オートファジーの定量的評価方法の開発

自噬定量评价方法的建立

基本信息

批准号：
17657069
负责人：
水島昇
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University (2006)Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research (2005)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本課題では哺乳類細胞を用いて、客観性のあるオートファジーの定量的評価方法を開発することを目的としている。昨年度から試みているpH感受性色素(CypHer5)で細胞質からリソソームへの移動を追跡する方法を今年度さらに検討を重ねた。CypHer5をBSAやIgGなどのタンパク質に共有結合させ、これを細胞質にマイクロインジェクションした。その結果、リソソームへの移動がかなり抑制されたが依然としてマクロオートファジー非依存的にリソソームへ到達してしまうことが結論された。現在ワルトマニンなどのPI3K阻害剤などを用いて、ミクロオートファジーの関与などをさらに追求している。現在のオートファジーの定量的解析の問題点のひとつとして、オートファジーの理想的な阻害方法がないことがあげられる。そこで、私たちはAtg5ノックアウトマウスに由来する線維芽細胞を利用して、テトラサイクリンによる遺伝子誘導系を利用して、「突然」オートファジー能を欠損あるいは回復できる細胞株を作製した。例えばこれを用いることによってオートファジーは通常の培地で培養している限り細胞の大きさにはほとんど影響しないが、栄養飢餓による細胞萎縮には正の関与をしていることなどを明らかとした。また現在多くの研究においてLC3というオートファゴソーム膜タンパク質の挙動でオートファジーの活性が評価されているが、LC3の標識が真のオートファゴソームを示すだけではなく、単なるタンパク質凝集に非特異的に含まれてしまう場合があることに気がついた。そこでこの方法の問題点と対応策についても論文発表を行った。

该主题旨在开发一种使用哺乳动物细胞自噬的客观定量评估方法。今年，我们一直在考虑如何使用pH敏感的染料（Cypher5）跟踪细胞质向溶酶体的运动，这是我们自去年以来一直在尝试的。 Cypher5与BSA和IgG等蛋白质共价结合，并将其显微注射到细胞质中。结果得出的结论是，迁移到溶酶体受到了显着抑制，但仍以大噬菌的非依赖性方式达到溶酶体。目前，该公司正在使用PI3K抑制剂（例如Waltmannin）进一步追求微噬菌体的参与。当前对自噬的定量分析的问题之一是缺乏抑制自噬的理想方法。因此，我们使用了源自ATG5基因敲除小鼠的成纤维细胞来产生细胞系，这些细胞系可能会通过使用四环素使用基因诱导系统“突然”“突然”缺乏或从自噬电位中恢复过来。例如，使用这种方法表明，只要在正常培养基中培养自噬，自噬对细胞尺寸的影响很小，但是它积极地参与了由营养饥饿引起的细胞萎缩。此外，许多研究现在已经评估了自噬在称为LC3的自噬体膜蛋白的行为中的活性，但是我们注意到LC3的标记不仅显示了真正的自噬体，而且还可以非特定于MERE蛋白质聚集中。因此，我们还发表了有关此方法的问题和对策的论文。