オートファゴソーム・リソソーム融合の分子メカニズムの解析

自噬体-溶酶体融合的分子机制分析

基本信息

批准号：
15F15082
负责人：
水島昇
金额：
$ 0.77万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15F15082/
关键词：
オートファゴソームリソソーム

项目摘要

オートファジーは細胞質の一部をリソソームで分解するための進化的に保存された細胞機能である。細胞質を取り囲んだオートファゴソームとリソソームが融合することで分解が達成される。リソソームとオートファゴソームの融合にはSNAREタンパク質であるSyntaxin 17（STX17）、SNAP29、VAMP8、および繋留因子としてHOPS複合体が必要である（Jiang et al. Mol Biol Cell 2014）。STX17は完成されたオートファゴソームにのみ結合し、まだ閉鎖が終わっていない形成中間体には結合しない。また、STX17はオートファゴソームだけではなく、ミトコンドリアや小胞体にも局在する。しかし、飢餓時にはミトコンドリアや小胞体への局在は軽減し、オートファゴソームに効率よく集積する。そこで、オートファゴソームとリソソームの融合機構を明らかにする一端として、本研究では栄養飢餓依存的にSTX17が特異的にオートファゴソームへ局在できるメカニズムを明らかにすることを目指した。HeLa細胞、HEK293T細胞、マウス線維芽細胞にGFP融合したSTX17 cDNAをコードするレトロウイルス、あるいはプラスミドを用いて遺伝子導入し、ウェスタンブロット法および蛍光顕微鏡法によって解析した。オートファジーを誘導しうる飢餓によってSTX17はミトコンドリアや小胞体から離脱し、よりオートファゴソームに結合しやすくなる。そこで飢餓依存的にSTX17分子自体に変化が生じている可能性を考え、ウェスタンブロット法による解析を行った。その結果、飢餓によってGFP-STX17のバンドが一部上方にシフトすることが判明した。これは脱リン酸化酵素処理によって消失するため、STX17のリン酸化型であると考えられた。この修飾がSTX17の局在決定に関与する可能性が示唆された。

自噬是一种进化保守的细胞功能，可用于细胞质部分的溶酶体降解。降解是通过在细胞质周围的自噬体和溶酶体融合来实现的。溶酶体 - 自助体融合需要SNARE蛋白语法17（STX17），SNAP29，VAMP8和HOPS复合物作为绑扎因子（Jiang等人Mol Biol Cell 2014）。 STX17仅与完整的自噬体结合，并且不与尚未闭合的中间体结合。此外，STX17不仅局限于自噬体，而且还属于线粒体和内质网。然而，在饥饿期间，将其定位到线粒体和内质网中减少，并且在自噬体中有效地进行积累。因此，作为自噬小体和溶酶体之间融合机制的一部分，本研究旨在阐明STX17可以以营养饥饿的方式专门定位于自噬小体的机制。使用编码已融合到HeLa细胞，HEK293T细胞和小鼠成纤维细胞或质粒的STX17 cDNA的逆转录病毒转染基因，并通过蛋白质印迹和荧光显微镜进行分析。可以诱导自噬的饥饿会导致STX17脱离线粒体和内质网，使其更有可能与自噬体结合。因此，我们考虑了STX17分子本身可以经历饥饿依赖性变化的可能性，并使用蛋白质印迹对其进行了分析。结果，发现由于饥饿，GFP-STX17的乐队被向上移动。这被认为是STX17的一种磷酸化形式，因为通过去磷酸化酶处理消除了它。有人提出，这种修改可能参与确定STX17的定位。