骨髄由来巨核球の分化成熟過程におけるトロンボポエチン受容体発現機構の解析

骨髓源性巨核细胞分化成熟过程中血小板生成素受体表达机制分析

基本信息

批准号：
10771001
负责人：
春原正隆
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The Nippon Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10771001/
关键词：
巨核球トロンボポエチントロンボポエチン受容体

项目摘要

米国ジェネンテイック社は、我々と共同で、CMK細胞にc-mpl遺伝子[トロンボポエチン(TPO)受容体遺伝子]が発現していることを利用し、世界に先駆けてTPOの発現とその遺伝子の単離に成功した(Nature369:533-538,1994)。また、KaushanskyらによりマウスTPOが、CMKの分化誘導を行うことが示され、さらにTPOがendomitosisをも惹起する強力な分化誘導因子であることが判明した(Nature369:568-571,1994)。そこで、CMK細胞を用いて、TPO分化誘導時におけるc-Mpl蛋白発現状況の経時的変化およびc-mpl遺伝子mRNA,c-mpl遺伝子プロモーター活性の変化を各々解析し、巨核球分化成熟過程におけるTPO受容体発現機構の解析および分化誘導時における形態的変化について検討を加えることを目的とし研究を行ないました。1)巨核球細胞表面上のc-Mpl発現状況の経時的変化に関しては、FACSによる解析が非常に困難で、市販されている唯一の抗体である米国ジェンザイムの社c-Mpl抗体では結果が得られなかったため、米国ZYMOGENETICS社に依頼した結果、FACS解析可能なc-Mpl抗体を特別に分与してもらえることになった。そこで、この抗体を用いてCMK細胞を米国ジェネンテック社より特別に分与されたTPOにて分化誘導後、細胞表面上のトロボポエチン(TPO)受容体(c-Mpl)発現の経時的変化をFACSにて解析したところ、TPO処理後1時間で細胞表面上のc-Mpl[トロボポエチン(TPO)受容体]のダウンレギュレーションが認められた。その後TPO処理後3時間でc-Mpl[トロンボポエチン(TPO)受容体]のダウンレギュレーションが最大となり、その後はアップレギュレーションすることを確認いたしております。2)さらに、上記のFACS解析と同じ条件下でのTPO処理によるc-Mpl発現状況の経時的変化を、米国ジェンザイム社のc-Mpl抗体にて免疫沈降法およびウエスタンブロッテイング法にて解析を試みたが結果が得られませんでした。現在、免疫沈降法およびウエスタンブロテイング法解析可能なc-Mpl抗体を特別に分与して頂けることになっており今後TPO分化誘導時におけるTPO受容体数変化を定量的に解析検討したいと考えております。3)米国ジェネンテック社より特別に分与されたトロンボポエチン(TPO)にてCMK細胞の分化誘導を行い、TPO分化誘導時におけるCMK細胞のc-mpl遺伝子プロモーター活性の経時的変化に関しましては、c-Mpl[トロボポエチン(TPO)受容体]のアップレギュレーションに呼応するようにTPO処理後24時間でc-mpl遺伝子プロモーター活性はピークを迎え、以降減衰し、TPO処理前の活性に戻ることを確認いたしております。

美国基因泰克公司与我们合作，利用c-mpl基因[血小板生成素（TPO）受体基因]在CMK细胞中表达的事实，在世界上第一个表达TPO并分离出它的基因。取得了成功（Nature369:533-538, 1994）。此外，Kaushansky等人表明，小鼠TPO诱导CMK分化，并且还发现TPO是强分化诱导因子，也诱导子宫内有丝分裂(Nature 369:568-571, 1994)。因此，我们利用CMK细胞，分析了TPO分化诱导过程中c-Mpl蛋白表达状态的时间变化以及c-mpl基因mRNA和c-mpl基因启动子活性的变化。受体表达机制并检查分化诱导过程中的形态变化。 1)关于巨核细胞表面c-Mpl表达状态的时间变化，通过FACS分析极其困难，并且唯一市售的抗体，来自美国的Genzyme的c-Mpl抗体，没有得出任何结果。因此，我们要求美国ZYMOGENETICS, Inc.提供一种可以通过FACS进行分析的特殊c-Mpl抗体。因此，我们使用该抗体与美国Genentech专门提供的TPO诱导CMK细胞分化，然后利用FACS观察细胞表面trobopoietin（TPO）受体（c-Mpl）表达随时间的变化。分析时，TPO 处理后 1 小时观察到细胞表面的 c-Mpl [trobopoietin (TPO) 受体] 下调。我们已经证实，c-Mpl [血小板生成素（TPO）受体]的下调在TPO治疗后3小时达到最大，然后上调。 2)此外，使用我尝试但得到的来自美国Genzyme的c-Mpl抗体，使用免疫沉淀和蛋白质印迹分析在与上述FACS分析相同的条件下由于TPO处理而导致的c-Mpl表达状态随时间的变化。没有结果。我们目前正在接收特殊供应的c-Mpl抗体，可以通过免疫沉淀和蛋白质印迹方法进行分析，并且我们希望在未来定量分析TPO分化诱导过程中TPO受体数量的变化。 3)使用美国Genentech公司专门提供的血小板生成素(TPO)诱导CMK细胞分化。我们已经证实，c-mpl 基因启动子活性在 TPO 处理后 24 小时达到峰值，响应 [trobopoietin (TPO) 受体] 的上调，然后下降并恢复到 TPO 处理前的活性。