巨核球の増殖分化を担うトロンボポエチン受容体の活性化機構の分子構造基盤

负责巨核细胞增殖和分化的血小板生成素受体激活机制的分子结构基础

基本信息

批准号：
26293009
负责人：
黒木良太
金额：
$ 7.57万
依托单位：
Japan Atomic Energy Agency
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-01 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

H26年度は下記の2つの項目を実施した。1）Cys/Ala変異型TPOR(C/A-TPOR)の骨髄細胞への発現とTPOリガンドによる細胞増殖シグナルの確認細胞外領域に存在する遊離型Cys残基をAlaに置換したTPOR全長遺伝子(C/A-TPOR)を、骨髄由来の細胞株であるFDC-P2細胞に導入して発現させ、TPOリガンド濃度に対する細胞増殖を定量的に評価し、同じくFDC-P2細胞に発現させた野生型TPORに対するTPOによる細胞増殖を検討し、細胞応答におけるC/A-TPORと野生型TPORの同等性を確認することができた。本実験で用いたリガンドであるTPOは、大腸菌発現した試料をリフォールディング後、イオン交換クロマトグラフィーにて精製して用いた。2）HEK293細胞を用いたC/A-ecTPORの大量発現とリガンドカラムによる精製遊離型Cysを除去したTPORの細胞外領域(C/A-ecTPOR)の発現を、動物細胞(HEK293細胞)を用いて実施した。目的のC/A-ecTPORは、培養液中に主要な蛋白質として発現した。発現させたC/A-ecTPORを培養上清から精製するために、アフィニティークロマトグラフィー担体に結合させるリガンド候補を検討した。TPOそのもの、および数種類のTPORモノクローナル抗体を用いて精製の予備検討を行ったところ、いずれのリガンドも効果的に目的C/A-ecTPORを濃縮することができた。予備的な精製によって、C/A-ecTPORの精製にはTPORモノクローナル抗体カラムを用い、高い純度の試料を確保できた。

2012年度，我们实施了以下两项项目。 1) Cys/Ala 突变型 TPOR (C/A-TPOR) 在骨髓细胞中的表达以及通过 TPO 配体确认细胞增殖信号全长 TPOR 基因，其中细胞外区中存在的游离 Cys 残基被 Ala 取代 ( C/A-TPOR) 到 FDC-P，一种骨髓来源的细胞系。我们还检测了 TPO 对 FDC-P2 细胞中表达的野生型 TPOR 诱导的细胞增殖，并定量评估了 TPO 配体浓度的细胞增殖。 TPOR。 TPO，本实验中使用的配体，在大肠杆菌中表达的样品重折叠后通过离子交换色谱法纯化。 2) 使用 HEK293 细胞大规模表达 C/A-ecTPOR，并使用配体柱进行纯化使用动物细胞 (HEK293 细胞) 进行已除去游离 Cys 的 TPOR 胞外区 (C/A-ecTPOR) 的表达）。目标C/A-ecTPOR作为培养基中的主要蛋白质表达。为了从培养物上清液中纯化表达的C/A-ecTPOR，我们研究了可以与亲和层析载体结合的候选配体。使用TPO本身和几种类型的TPOR单克隆抗体进行了初步纯化研究，所有配体都能够有效浓缩目标C/A-ecTPOR。通过初步纯化，我们可以使用TPOR单克隆抗体柱对C/A-ecTPOR进行纯化，保证了样品的高纯度。