NOによる細胞傷害へのグリオキサラーゼIの関与

乙二醛酶 I 参与 NO 诱导的细胞损伤

基本信息

批准号：
12771415
负责人：
光本篤史
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者はヒト細胞内の糖代謝で派生する毒性物質メチルグリオキサールを解毒する酵素、グリオキサラーゼI(Glo I)がNO特異的かつ可逆的に酸化修飾され不活性化されることを蛋白質の2次元電気泳動法を用いた解析から見い出してきた。本年度、Glo IとNOとのin vitroでの反応性について検討した結果、NO単独では反応せず、NOとグルタチオン(GSH)の付加体であるS-ニトロソグルタチオン(GSNO)と相互作用することを明かにした。また競合阻害剤の存在下ではその反応が完全に抑制されることから、Glo IとGSNOとの相互作用には酵素の気質認識部位が強く関与していることが示された。この結果はGlo Iがグルタチオン誘導体を基質とすることから、相互作用の場が基質認識部位である可能性を示している。細胞内GSHを1%以下に枯渇した条件ではNOに対するGlo Iの反応性が消失した。また細胞膜透過型のGlo I競合阻害剤によりGlo IのNO応答性は消失した。以上のことから、NOは細胞内でGSHと結合してGSNOとなり、Glo Iと反応するものと考えられる。さらにNOの作用点を明かにするため、ヒトGlo I遺伝子のcDNAクローニングを行った。NOによる構造修飾が還元可逆的であることから、システイン残基(Cys)の寄与を考え、全部で4つのCysをそれぞれセリン(Ser)に変えたミュータントを作成した。現在までに、cDNAクローニングを終了し、シークエンサーにて配列を確認した。今後、組み換え蛋白質を発現精製し、NOに対する反応性を検討することによって、NOに対する作用点とその修飾構造について明かにしていく予定である。

申请人发现，乙二醇酶I（GLO I）是一种将源自人类细胞中葡萄糖代谢的有毒物质甲基乙二醇排毒的酶，并非特异性地氧化和可逆地修饰，并通过使用二维电子电动物分析蛋白质进行了氧化修饰和灭活。今年，我们研究了GLO I和NO之间的体外反应性，并揭示了NO不会与自身反应并与S-硝基谷硫酸盐（GSNO）相互作用，NO和Glutathione（GSH）（GSH）。此外，在存在竞争性抑制剂的情况下，该反应完全抑制了，表明该酶的气质识别位点与Glo I和GSNO之间的相互作用很强。该结果表明GLO I是基于谷胱甘肽衍生物的底物，这表明相互作用领域可能是底物识别位点。在细胞内GSH耗尽至1％或以下的条件下，Glo I对NO的反应性丢失。此外，GLO I的无响应能力被细胞膜渗透的GLO I竞争抑制剂消除。从上面看，人们认为没有与细胞中的GSH结合并变成GSNO，并且与Glo I反应。此外，执行了人Glo I基因的cDNA克隆以阐明NO的作用点。由于结构修饰是降低的，因此我们创建了突变体，这些突变体总共将四个Cys转化为丝氨酸（SER），考虑到半胱氨酸残基（CYS）的贡献。迄今为止，cDNA克隆已经完成，序列已通过序列确认。将来，我们将通过表达和纯化重组蛋白并检查其反应性来揭示针对NO及其修饰结构的作用点。