鶏脂肪細胞リポプロティンリパーゼ遺伝子のクローニングとその発現制御領域の解明

鸡脂肪细胞脂蛋白脂肪酶基因的克隆及其表达控制区的阐明

基本信息

批准号：
10760158
负责人：
佐藤幹
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10760158/
关键词：
リポプロテインリパーゼ鶏脂肪蓄積 cDNAクローニング

项目摘要

脂肪過剰蓄積のメカニズムの解明とその制御法の開発を目標として、脂肪組織での主要な脂肪蓄積調節酵素であるリポプロテインリバーゼ(LPLase)の遺伝子・蛋白質発現機構を明らかにすることを目的とした。本年度は、鶏脂肪細胞培養系の作成と脂肪組織LPLase cDNAのクローニングを行なった。(1) 鶏脂肪細胞培養系の作成無菌的に採取した7日齢ブロイラー雛の脂肪組織を供試し、酵素消化法により脂肪前駆細胞を調製した。鶏脂肪前駆細胞は10%FBSを含むM199(Growth medium)で増殖し、Growth mediumに10mM Glucose、200μg/ml Insulin、250nM Dexamethason、33μM biotin、17μM pantothenaeおよび1mM oleic acidを添加すると24時間後に脂肪滴を有する脂肪細胞に分化した。分化した脂肪細胞は、細胞内にトリグリセリドを蓄積し、LPLase活性およびVLDL receptor、LeptinのmRNAを発現しており、鶏の脂肪蓄積機構を分子生物学的に解析するのに適した細胞であることが確認された。(2) 脂肪細胞LPLaseのcDNAクローニングまず、LPLase発現の活発な鶏脂肪細胞のcDNAライブラリー(ベクター:pBluescript II KS+)を作成した。次に、ブロイラー精製LPLaseのアミノ酸配列よりプローブを作成し、cDNAライブラリーを用いたコロニーハイブリダイゼーションで完全長のcDNAをクローニングすることに成功した。ブロイラーLPL cDNAは2,297bpで、490個のアミノ酸をコードしていた。また、鶏LPLのタンパク質部分の推定分子量は52,601、等電点は7.91と推定され、糖鎖付加を経て活性を持つ成熟LPLとなることが推測された。

为了阐明过量脂肪积累的机制并开发控制方法，我们旨在阐明脂蛋白肝酶（LPLase）（脂肪组织中主要的脂肪积累调节酶）的基因和蛋白质表达机制。今年，我们创建了鸡脂肪细胞培养系统并克隆了脂肪组织LPLase cDNA。 (1)鸡脂肪细胞培养体系的建立无菌采集7日龄肉鸡的脂肪组织，通过酶消化制备前脂肪细胞。鸡前脂肪细胞在含有10% FBS的M199（生长培养基）中生长，当生长培养基中添加10mM葡萄糖、200μg/ml胰岛素、250nM地塞米松、33μM生物素、17μM泛酸和1mM油酸时，24小时后形成脂滴。小时分化为脂肪细胞。分化的脂肪细胞积累细胞内甘油三酯并表达 LPLase 活性以及 VLDL 受体和瘦素的 mRNA，使其成为对鸡脂肪积累机制进行分子生物学分析的合适细胞。 (2)脂肪细胞LPLase的cDNA克隆首先，创建活跃表达LPLase的鸡脂肪细胞的cDNA文库(载体：pBluescript II KS+)。接下来，我们根据纯化的肉鸡 LPLase 的氨基酸序列创建了探针，并使用 cDNA 文库通过菌落杂交成功克隆了全长 cDNA。肉鸡LPL cDNA为2,297 bp，编码490个氨基酸。此外，鸡LPL的蛋白质部分的分子量估计为52,601，等电点估计为7.91，表明其通过糖基化成为活性成熟LPL。