血管内皮細胞の傷害性刺激に伴って発現量が増加する新規遺伝子産物RTPの機能探索

新型基因产物RTP的功能探索，其表达水平随血管内皮细胞的毒性刺激而增加

• 批准号: 09780590
• 负责人: 小亀 浩市
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: National Cardiovascular Center Research Institute
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780590/
• 关键词: 血管内皮細胞; ホモシステイン; リゾフォスファチジルコリン; 血栓症; 動脈硬化; 遺伝子発現; RTP; 細胞傷害

動脈硬化や血栓症には、血管内皮傷害が大きく関与している。最近我々は、ヒト血管内皮細胞において、内皮傷害誘導物質として知られるホモシステインと動脈硬化促進物質として知られるリゾフォスファチジルコリンで共通に発現誘導される未知遺伝子1種を発見した。この遺伝子は新規蛋白質(RTPと命名)をコードしているが、その生理機能は不明である。そこで本研究では、機能解明を最終目的として設定し、RTPの生物学的諸性質を解析した。(1) RTP特異的抗体の作成とそれを用いた解祈まず、大腸菌に発現させたRTP-GST融合蛋白質でウサギを免疫し、RTP特異的抗体を作成した。ウェスタンブロット解析を行った結果、RTPは約47kDa蛋白質であり、ホモシステイン刺激した細胞での発現量増加が確認された。さらに、RTPは培養細胞の細胞質に局在することが判明した。この存在様式は細胞の刺激受容に依存せず、RTPは恒常的に細胞質全体に分布することが示唆された。(2) RTPのリン酸化抗体を用いた解析から、RTPはリン酸化されていることを示唆するデータを得た。これを検証し、プロテインキナーゼAがRTPを生理的基質とすること、他のキナーゼも関与することを明らかにした。(3) RTP相互作用蛋白質の探索RTPと相互作用する蛋白質を探索するため、Yeast 2-Hybrid Systemを行った。RTP発現量の多い組織である腎臓のcDNAライブラリー1.1×10^7クローンをスクリーニングした結果、1陽性クローンが得られた。現在、その解析を進めている。(4) RTP発現と病態との関連免疫組織化学的解析から、RTPは腎臓の近位尿細管や小腸絨毛で著しく発現していることがわかった。そこで、種々の病態を示す腎臓を正常腎臓と比較し、病変悪化に伴ってRTP量が増加することを見出した。 以上の成果から、未だRTPの機能解明という目標には達していないものの、RTPに関する多くの貴重な知見が得られた。なお、本研究の一部を記述した論文をJ.Biol.Chem.誌に投稿し、現在再審査を受けているところである。

血管内皮损伤是动脉硬化和血栓形成的主要因素。最近，我们发现了一种未知基因，通常通过同型半胱氨酸（称为内皮损伤诱导剂）和溶血磷脂酰胆碱（称为动脉粥样硬化促进剂）在人血管内皮细胞中表达。该基因编码一种新型蛋白质（称为RTP），但其生理功能尚不清楚。因此，在这项研究中，我们设定了阐明功能并分析RTP的生物学特性的最终目标。 （1）创建RTP特异性抗体并为使用它们祈祷，并用大肠杆菌中表达的RTP-GST融合蛋白免疫兔子，以产生RTP特异性抗体。蛋白质印迹分析表明，RTP约为47 kDa蛋白，并且在同半胱氨酸刺激的细胞中证实了表达水平的升高。此外，发现RTP位于培养细胞的细胞质中。这种存在模式不取决于细胞刺激的接收，这表明RTP在整个细胞质中分布​​了组成型。 （2）使用磷酸化抗体进行RTP的分析得出的数据表明RTP是磷酸化的。这得到了证实，并揭示了蛋白激酶A使RTP成为生理底物，并且涉及其他激酶。 （3）搜索RTP相互作用的蛋白来搜索与RTP相互作用的蛋白质，我们执行了酵母2杂交系统。从肾脏中筛选1.1×10^7的cDNA库克隆，这是一种高RTP表达水平的组织，导致一个阳性克隆。我们目前正在进行分析。 （4）RTP表达和病理学的免疫组织化学分析表明，RTP在肾脏的近端小管和小肠绒毛中显着表达。因此，我们比较了表现出各种病理状况的肾脏与正常肾脏，发现RTP水平随着病变恶化而增加。以上结果为RTP提供了丰富的宝贵见解，尽管尚未达到RTP功能的目的。一篇描述一部分研究的论文已提交给J.Biol.Chem杂志，目前正在重新检查。

项目成果

小亀浩市: "血管内皮傷害に伴う遺伝子発現の変化." 血液アゴラ. 4. 59-70 (1997)

Hiroshi Ogame：“与血管内皮损伤相关的基因表达变化。”Blood Agora。 4. 59-70 (1997)

Koichi Kokame: "Nonradioactive differential display cloning of genes induced by homocysteine in vascular endothelial cells." Methods. 16(4). 434-443 (1998)

Koichi Kokame：“血管内皮细胞中同型半胱氨酸诱导的基因的非放射性差异显示克隆。”

小亀浩市: "TAFI活性化とトロンボモジュリンのドメイン構造." 日本血栓止血学会誌. 9(6). 445-450 (1998)

Hiroshi Ogame：“血栓调节蛋白的 TAFI 激活和结构域”。日本血栓和止血学会杂志 9(6)。

Naoaki Sato: "Lysophosphatidylcholine decreases the synthesis of tissue factor pathway inhibitor in human umbilical vein endothelial cells." Thromb.Haemostas.79(1). 217-221 (1998)

Naoaki Sato：“溶血磷脂酰胆碱减少人脐静脉内皮细胞中组织因子途径抑制剂的合成。”

宮田敏行: "関西血栓フォーラム「血小板血栓形成の分子機構」" ライフサイエンス出版, 253 (1997)

宫田敏之：《关西血栓论坛“血小板血栓形成的分子机制》生命科学出版社，253（1997）