Characterization of neuron-like cells differentiated from human dental pulp stem cells

人牙髓干细胞分化的神经元样细胞的表征

基本信息

批准号：
21K10172
负责人：
白川哲夫
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

レット症候群女児および健常女児の歯髄由来の間葉系幹細胞（MSCs）について、市販の間葉系幹細胞専用培地を用いて培養したのち、Gene Query Human Cell Surface Markers qPCR Array Kit を用いて細胞表面抗原を検索した。そののち、健常女児の抜去歯より採取した歯髄組織について、3%グリオキサール溶液で固定後、凍結組織切片を作成した。CD69ならびにCD4、CD8、CD103のいずれかについて免疫蛍光二重染色を行い、共発現の有無を検討した。続いて低接着表面三次元培養プレートにて、健常女児歯髄由来MSCsを培養し、細胞の活性ならびに増殖能を調べた。Cell Surface Markers qPCR Array Kitにより、細胞表面抗原88種について、レット症候群女児由来のMSCsにおいて発現レベルの高い抗原を検索した。その結果、これまで歯髄由来MSCsで発現の報告のないCD69について、レット症候群女児由来MSCsのみに高い発現を確認した。そこでその制御機序を明らかにする目的でTNF-αによる刺激を行い、CD69の発現をリアルタイムPCR法で調べた。その結果、レット症候群女児および健常女児の歯髄由来MSCsでは、ともにTNF-α刺激によりCD69 mRNAが濃度依存的に増加することを確認した。また健常女児歯髄由来MSCsについての免疫蛍光二重染色で、CD69とCD4、CD8、CD103のいずれかが共発現している細胞の存在を確認したが、その数はわずかであった。続いて、歯髄由来MSCsを最長で7日間静置培養し、神経細胞への分化誘導の前段階としてスフェロイド形成を試みた。しかし培養開始後2日から3日で100から1000個程度の細胞塊の形成を認めたものの、その後増殖は停止し、7日後に細胞塊内部の細胞がアポトーシスを起こしていることを確認した。

专门使用市售的间充质干细胞培养来自Rett综合征和健康女孩的女孩的间充质干细胞（MSC），然后使用基因查询人类细胞表面标记QPCR阵列套件搜索细胞表面抗原。之后，用3％的乙二醇溶液固定从健康女孩提取的牙齿中收集的纸浆组织，制备冷冻的组织切片。对CD69，CD4，CD8或CD103进行免疫荧光双染色，并检查了共表达的存在或不存在。随后，将源自果肉中的果肉中的MSC培养在低粘性的表面三维培养板上，以检查细胞活性和增殖潜力。细胞表面标记QPCR阵列套件搜索了RETT综合征女孩MSC中具有高表达水平的88个细胞表面抗原。结果，CD69以前没有在纸浆衍生的MSC中表达的报道，仅在RETT综合征女孩的MSC中得到高度表达。因此，为了阐明调节机制，用TNF-α进行了刺激，并通过实时PCR检查了CD69的表达。结果，已经证实，来自RETT综合征的RETT综合征和健康女孩的纸浆衍生的MSC中CD69 mRNA浓度依赖性增加。此外，在健康女孩中衍生出果肉的MSC的免疫荧光双染色证实存在共表达CD69，CD4，CD8或CD103的细胞，但数量很小。随后，将纸浆衍生的MSC静态培养长达7天，并尝试将球体形成作为诱导分化为神经元的阶段。然而，尽管在培养开始后的2至3天内观察到大约100至1000个细胞肿块的形成，但随后停止了增殖，并且可以证实细胞肿块内部的细胞在7天后经历了凋亡。