内因性アンチセンスRNAによる転写因子活性制御と歯胚分化抑制のメカニズム

内源反义RNA调控转录因子活性及抑制牙胚分化的机制

基本信息

批准号：
16659568
负责人：
白川哲夫
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659568/
关键词：
Msx1 Pax9 内因性アンチセンスRNA 歯胚発生 in situ hybridization法神経幹細胞 GFP 胎仔マウス

项目摘要

内因性Msx1アンチセンスRNAとMsx1遺伝子の相互作用が先天性歯胚欠如に関与している可能性を検証するため、歯胚形成過程でのMsx1およびPax9の内因性アンチセンスRNAの発現と、各々のセンスRNAとアンチセンスRNAの相互作用を動物実験系を用いて検討した。1)マウス胎仔歯胚発生領域でのMsx1およびPax9の内因性アンチセンスRNAの検出麻酔下にて妊娠マウスから胎生9,12,15,18日目の胎仔を分離し、歯胚発生領域を含め、頭部よりtotal RNAを抽出した。得られたサンプルについて、RT-PCRによりMsx1およびPax9のセンスRNAおよびアンチセンスRNAの検出を試みた。Msx1のセンスRNAおよびアンチセンスRNAについては胎生期のいずれのステージにおいてもPCR産物が検出された。一方、Pax9のセンスRNAおよびアンチセンスRNAの検出に関しては、センスRNAのPCR産物のみ検出が可能であった。このことから、Pax9のアンチセンスRNAについては、マウスの胎生期において発現していないかあるいは発現量がきわめて少ないものと考えられた。Msx1のセンスRNAおよびアンチセンスRNAについてのin situ hybridization法による検出については、胎仔マウスの急速凍結切片を作製し、digoxigeninでラベルした非放射性プローブでのシグナル検出を試みたところ、センスRNAは胎生9日から、アンチセンスRNAでは胎生12日から上下顎骨領域に発現が認められた。Msx1のセンスRNAおよびアンチセンスRNA、ならびにPax9のセンスRNAが、歯胚形成期にどのような相互作用を発揮しているかについてはMSX1およびPAX9の定量を含め今後の検討が必要である。2)神経幹細胞の胎仔顎骨部への移植と移植後の分化についての検討胎生15日目のGFPトランスジェニックマウス胎仔の線条体より神経幹細胞を採取し、胎生18日目のマウスより分離した顎骨体部に移植し培養を行った。4%paraformaldehydeにて固定したのち、薄切切片を作製してレーザー共焦点顕微鏡による蛍光観察を行ったところ、グリア細胞様の形態を示す細胞への分化を確認した。歯胚組織へのGFP陽性細胞の侵入は認められなかった。

为了验证内源性Msx1反义RNA与Msx1基因之间的相互作用参与先天性牙胚缺陷的可能性，我们研究了牙胚形成过程中Msx1和Pax9内源性反义RNA的表达情况，以及正义RNA之间的相互作用。使用动物实验系统研究反义RNA。 1)小鼠胚胎牙胚发育区域Msx1和Pax9内源性反义RNA的检测。从麻醉下的妊娠小鼠中分离出胚胎第9、12、15、18天的胎儿，包括牙胚发育区域，总RNA。从头部提取。对于获得的样本，我们尝试通过RT-PCR检测Msx1和Pax9正义RNA和反义RNA。在所有胚胎阶段均检测到Msx1正义RNA和反义RNA的PCR产物。另一方面，对于Pax9正义RNA和反义RNA的检测，仅能够检测到正义RNA PCR产物。由此认为，Pax9反义RNA在小鼠胚胎期不表达或表达水平非常低。关于通过原位杂交法检测Msx1正义RNA和反义RNA，我们制备了胎儿小鼠的速冻切片并尝试用地高辛标记的非放射性探针进行信号检测。在反义RNA中，在上颌骨和上颌骨中观察到表达。胚胎第 12 天的上颌骨区域。未来的研究，包括 MSX1 和 PAX9 的定量，需要确定 Msx1 正义 RNA 和反义 RNA 以及 Pax9 正义 RNA 在牙胚形成过程中如何相互作用。 2）神经干细胞移植到胎儿颌骨区域及其移植后分化的研究从胚胎GFP转基因小鼠胎儿第15天的纹状体中收集神经干细胞，并从第18天的小鼠分离颌骨。胚胎生命被移植到体内并进行培养。用4％多聚甲醛固定后，制备薄片并使用激光共聚焦显微镜进行荧光观察，证实分化为表现出神经胶质细胞样形态的细胞。没有观察到 GFP 阳性细胞侵入牙胚组织。