性腺激素调控SLCO2A1突变导致原发性肥大性骨关节病发病的分子机制研究

Hypertrophic osteoarthropathy, also known as primary or secondary pachydermoperiostosis, belongs to osteosclerosis featured by digital clubbing, periostosis and pachydermia. In 2012, we first reported that primary hypertrophic osteoarthropathy (PHO) is caused by homozygous mutations in SLCO2A1gene coding the prostaglandin transporter. Therefore, the finding was named as autosomal recessive type 2 (PHOAR2）by Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM 614441). Combining foreign report autosomal recessive type 1(PHOAR1) caused by HPGD gene coding hydroxyprostaglandin dehydrogenase 15-(NAD) (OMIM259100), the metabolic disturbance of PGE2 causing reduced degradation was underlying the pathogenesis of PHO. However, with dozens of PHOAR2 patients molecularly diagnosed, a significant age and gender bias has been noted: the onset typically occurs at puberty of males and postmenopause of females with lower ratio and more mild symptoms compared to that of males, and it is absent in PHOAR1. These considerable findings strongly indicate the crucial role of sex hormones in PGE2 transportation. However, the mechanism remained unknown so far. Our study intends to utilize the SLCO2A1 mutation knock-in mouse model basically established at present for depletion and replacement interventions of sex hormones, and clarify the exact impact and mechanism of sex hormones on PGE2 metabolism at the molecular, cell, and in vivo levels in the pathogenesis of primary PHO, which not only solve the problem of confused clinically for many years, but also for the prevention and treatment of PHO is of great significance.

肥大性骨关节病（厚皮骨膜增生症），是以杵状指、长骨骨膜增生和脸面皮肤增厚为特征的属于骨硬化症一类疾病，按病因不同分为原发性和继发性。我们于2012年在国际上首先报告了编码前列腺素转运蛋白的SLCO2A1基因纯合突变导致原发性肥大性骨关节病，后被OMIM命名为常隐2型，结合国外报告的1型是由编码PGE2降解酶基因(HPGD)突变引起，至此基本阐明了原发性肥大性骨关节病是PGE2降解减少而发病。但随着近年我们对常隐2型临床病例的积累，发现该型患者均是青春期发病的男性，而女性则在绝经后发病且症状轻微，显然发病存在显著性别差异，强烈提示性腺激素调节PGE2的转运和降解，但机制尚未阐明。本项目拟利用目前已基本建立的SLCO2A1突变敲入小鼠模型，予性腺激素剥夺和替代干预等，从细胞、分子和整体水平以明确本病发生中性激素对PGE2代谢之确切影响及机制，不但解决困惑临床多年之问题，而且对其防治具有重大意义

按照本项目计划书要求，我们在临床上进一步纳入原发性肥大性骨关节病患者，进行基因诊断及依托考昔临床药物研究，形成并完善该类罕见病的诊疗模式。同时，我们对在临床上发现的SLCO2A1基因突变致原发性肥大性骨关节病存在性别差异的现象进行探索，通过构建基因突变小鼠模型，进行细胞、分子和整体实验，以明确性激素对原发性肥大性骨关节病发病的分子机制。本研究包括： （1） 临床方面：原发性肥大性骨关节病（primary hypertrophic osteoarthropathy, PHO）基因诊断、临床特征及药物干预；（2）体外实验：根据临床鉴定的突变，构建体外突变细胞系，明确突变的影响及机制；（3）在体实验：构建SLCO2A1基因突变小鼠，进行功能试验，探索疾病的发病机制。建立了国际上最大PHO病例库，完成75个PHO家系（包括先证者及其家族成员）的致病基因鉴定和临床诊疗，进行临床表型和分子突变谱的总结，首次提出PHO疾病新分型- PHO常染色体显性（PHOAD），探索不同类型PHO的临床差异及表型与基因型联系，同时在国际上首次报告了依托考昔片临床干预6个月的改善杵状指和脸面皮肤皱纹的确切疗效。同时，本项目通过构建SLCO2A1突变细胞系进行体外功能试验，证实SLCO2A1基因p.Ala286GlnfsX35突变导致无法完整表达，并显著降低PGT对PGE2的转运功能，从而致病；使用CRISPR /Cas9技术分别构建了SLCO2A1基因c.del855A突变敲入小鼠和C57BL/6J-Slco2a1em1(flox-G938-1A)Smoc条件性点突变敲入小鼠，但是上述两种小鼠模型均存在纯合胚胎致死的情况，对全身点突变小鼠杂合型与野生型进行了X 线摄片、Micro-CT检查、组织H&E染色和qPCR等，未发现与野生型小鼠存在显著差异。为此，我们已经选取在患者发生率为6%的错义突变p.P496L，对应小鼠p.P468L，采用CRISPR/Cas9技术建立点突变小鼠，试图获得纯合突变小鼠，开展后续研究。. 本项目培养博士和硕士研究生各2名和1名（已毕业）；发表论文12篇，其中SCI收录论文4篇；国内外学术会议交流7次。本研究首次提出了PHO的新分型，提出其临床特征、基因突变谱及药物干预疗效，结合分子机制研究，为该类罕见病的诊断、治疗、遗传咨询及产前诊断提供了临床重要依据。

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