Functional nanoscopy of membrane deformations and fission by dynamin superfamily members

动力超家族成员膜变形和裂变的功能纳米观察

基本信息

项目摘要

PROJECT SUMMARY Membrane fission is associated with the breakage of a tiny nanometer-scale membrane neck connecting two separating/dividing membrane compartments at the late stages of division. Severing this neck in a timely and leakage-free manner is critical for normal functioning of endomembrane systems, hence membrane fission is performed by specialized and tightly-regulated protein machinery assembling on the neck. While our current mechanistic understanding of fission, in life and disease, is heavily based upon in vitro reconstitution approaches, such approaches rarely (if at all) reproduce confined and crowded environment of the neck. Instead, in vitro reconstitution has been mostly performed using large (sub-micron to micron scale) membrane templates of various physico-chemical properties, resulting in controversial outcomes and precluding rigorous mechanistic analysis of fission. This project is focused on creation of the next- generation in vitro approaches that reconstruct and quantify membrane fission at physiological length/time scales. We will combine nanotechnology with modern biophysical approaches and protein engineering to solve the long-standing puzzle of membrane fission mediated by the proteins of dynamin superfamily, which are intimately involved in intracellular fusion/fission and directly linked to various human pathologies. We will approach this problem from several different angles: - We will perform single-molecule analysis of dynamin oligomerization on membrane surfaces with precisely (2 nm) calibrated curvature (10-1 to 10-2 nm range) to identify and characterize elementary mechano-chemical units assembled by dynamin. We will determine (i) the pathways of dynamin oligomerization/self-assembly on a curved membrane surface, (ii) the size/geometrical arrangement of minimal oligomers capable of cooperative GTP hydrolysis and (iii) the effects of membrane curvature on self-assembly and GTPase activity of small dynamin oligomers. - We will assess membrane activity of individual dynamin oligomers (dimers and higher order multimers) at nano-confined membrane templates to determine how the force fields produced by dynamin are coupled to lipid rearrangements throughout fission. We will (i) measure the local forces produced by different dynamin oligomers and quantify associated membrane deformations and instabilities, and (ii) determine pathway(s) of lipid rearrangements and their dependence on the size/geometry of dynamin complexes and geometrical/mechanical parameters of membrane templates. - We will analyze effects of auxiliary proteins and critical mutations of dynamins, compare the self- assembly and fission pathways for different members of dynamin superfamily to distinguish general and protein-specific parameters (perhaps, even specific pathways) of membrane fission and unravel molecular mechanisms behind functional evolution and regulation of dynamin fission machinery.
项目摘要 膜裂变与一个小纳米尺度的膜颈断裂有关 在分裂的后期分开/分隔膜舱。及时切断脖子 无泄漏方式对于膜系统的正常功能至关重要,因此 裂变是通过在脖子上组装的专门和严格调节的蛋白质机械进行的。尽管 我们目前对生命和疾病中裂变的机械理解是基于体外的 重组方法,这种方法很少(如果有的话)繁殖局限和拥挤的环境 脖子。取而代 比例)各种物理化学特性的膜模板,导致有争议的结果和 排除裂变的严格机理分析。该项目的重点是创建下一步 在生理长度/时间上重建和量化膜裂变的体外方法 秤。我们将将纳米技术与现代生物物理方法和蛋白质工程结合起来 解决由Dynamin超家族蛋白介导的膜裂变的长期难题, 密切参与细胞内融合/裂变,并直接与各种人类病理相关。我们 将从几个不同角度解决这个问题: - 我们将对膜表面上的元分素寡聚化进行单分子分析 精确(2 nm)校准曲率(10-1至10-2 nm范围)以识别和表征 由Dynamin组装的基本机械化学单元。我们将确定(i) 动力蛋白低聚/自组装在弯曲膜表面上的途径,(ii) 能够合作GTP水解和(III)的最小寡聚物的尺寸/几何布置 膜曲率对小动力蛋白低聚物自组装和GTPase活性的影响。 - 我们将评估单个动力蛋白低聚物的膜活性(二聚体和高阶 多聚体)在纳米夹层的膜模板上,以确定力场如何 在整个裂变过程中,由Dynamin产生的蛋白质与脂质重排耦合。我们将 (i)测量由不同的动力蛋白低聚物产生的局部力量并量化相关的 膜变形和不稳定性,(ii)确定脂质重排的途径 它们对动力蛋白复合物和几何/机械的大小/几何形状的依赖性 膜模板的参数。 - 我们将分析辅助蛋白的作用和动力蛋白的关键突变,比较自我 Dynamin超家族不同成员的组装和裂变途径以区分 一般和蛋白质特异性参数(也许甚至是特定途径) 功能进化背后的膜裂变和分子机制 和元素裂变机械的调节。

项目成果

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