A STRATEGY TO QUANTIFY PROTEIN STABILITY

量化蛋白质稳定性的策略

基本信息

  • 批准号:
    8365801
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 2.18万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2011
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2011-09-01 至 2012-06-30
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

This subproject is one of many research subprojects utilizing the resources provided by a Center grant funded by NIH/NCRR. Primary support for the subproject and the subproject's principal investigator may have been provided by other sources, including other NIH sources. The Total Cost listed for the subproject likely represents the estimated amount of Center infrastructure utilized by the subproject, not direct funding provided by the NCRR grant to the subproject or subproject staff. The ubiquitin proteasome system (UPS) governs most of the regulated proteolysis in eukaryotes. Substrates destined for proteasomal degradation are often modified with ubiquitin. The ubiquitin is attached to these proteins by a series of enzymes called E1, E2, and E3. A degron is a primary degradation signal of UPS substrates that is recognized by E3 enzymes or chaperones. We have designed a high-resolution strategy to map the sequence-function relationship of known degrons and to discover degrons in a systematic and high throughput manner. We will combine simple genetic tools with high-throughput sequencing to characterize the degradation signal. Our system is based on the fact that yeast cells that express Ura3 die in the presence of 5-FOA because Ura3 converts 5-FOA into a toxic product. We can alter the stability of Ura3 by fusing it to degrons, which can affect the sensitivity of yeast to 5-FOA. We are currently optimizing this system using the well-characterized degradation signal Deg1 from Matα2 fused to Ura3. This fusion protein is under the control of galactose-regulatable promoter. After the expression of the Ura3-degron fusion is shut off by addition of glucose to the media, the stability of the Ura3-degron fusion in the cells is determined by testing how sensitive the cells are to 5-FOA. We plan to generate a library of mutant Deg1 degrons fused to Ura3 to determine the effect of mutations in the degron for their ability to destabilize Ura3. Cells that harbor functional Ura3-degron fusions will degrade the Ura3 and grow in media containing 5-FOA, and cells that express non-functional degrons will be lost. By comparing the sequences of degrons in the selected yeast to the input culture we will gain insight into how mutations affect the stability of Ura3.
该子项目是利用资源的众多研究子项目之一 由 NIH/NCRR 资助的中心拨款提供。子项目的主要支持 并且子项目的主要研究者可能是由其他来源提供的, 包括其他 NIH 来源。 子项目可能列出的总成本 代表子项目使用的中心基础设施的估计数量, NCRR 赠款不直接向子项目或子项目工作人员提供资金。 泛素蛋白酶体系统(UPS)控制着真核生物中大部分受调节的蛋白水解作用。用于蛋白酶体降解的底物通常用泛素修饰。 泛素通过一系列称为 E1、E2 和 E3 的酶附着在这些蛋白质上。 降解决定子是 UPS 底物的主要降解信号,可被 E3 酶或分子伴侣识别。我们设计了一种高分辨率策略来绘制已知降解决定子的序列-功能关系,并以系统和高通量的方式发现降解决定子。 我们将结合简单的遗传工具和高通量测序来表征降解信号。我们的系统基于以下事实:表达 Ura3 的酵母细胞在 5-FOA 存在下会死亡,因为 Ura3 将 5-FOA 转化为有毒产物。我们可以通过将 Ura3 与降解决定子融合来改变其稳定性,这会影响酵母对 5-FOA 的敏感性。 我们目前正在使用 Matα2 与 Ura3 融合的良好表征的退化信号 Deg1 来优化该系统。 该融合蛋白受半乳糖调节启动子的控制。 通过向培养基中添加葡萄糖来关闭 Ura3-降解决定子融合体的表达后,通过测试细胞对 5-FOA 的敏感性来确定细胞中 Ura3-降解决定子融合体的稳定性。我们计划生成与 Ura3 融合的突变 Deg1 降解决定子文库,以确定降解决定子中的突变对其破坏 Ura3 稳定性的能力的影响。 含有功能性 Ura3-降解决定子融合体的细胞将降解 Ura3 并在含有 5-FOA 的培养基中生长,而表达非功能性降解决定子的细胞将丢失。通过将所选酵母中的降解决定子序列与输入培养物进行比较,我们将深入了解突变如何影响 Ura3 的稳定性。

项目成果

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