INTERROGATION OF E3 UBIQUITIN LIGASE CATALYSIS BY DEEP MUTATIONAL SCANNING
通过深度突变扫描研究 E3 泛素连接酶催化作用
基本信息
- 批准号:8365800
- 负责人:
- 金额:$ 2.18万
- 依托单位:
- 依托单位国家:美国
- 项目类别:
- 财政年份:2011
- 资助国家:美国
- 起止时间:2011-09-01 至 2012-06-30
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:Amino AcidsBacteriophage T7BacteriophagesBindingBiologyBoxingCatalysisCell physiologyElementsEnzymesFundingFungal GenomeGenotypeGrantIn VitroLibrariesMutationNational Center for Research ResourcesPeptidesPrincipal InvestigatorProceduresProteinsReactionResearchResearch InfrastructureResourcesScanningSignal TransductionSourceSpecific qualifier valueTestingUbiquitinUbiquitin-Conjugating EnzymesUbiquitinationUnited States National Institutes of Healthcostinsightmutantresearch studyubiquitin-protein ligase
项目摘要
This subproject is one of many research subprojects utilizing the resources
provided by a Center grant funded by NIH/NCRR. Primary support for the subproject
and the subproject's principal investigator may have been provided by other sources,
including other NIH sources. The Total Cost listed for the subproject likely
represents the estimated amount of Center infrastructure utilized by the subproject,
not direct funding provided by the NCRR grant to the subproject or subproject staff.
Ubiquitin signaling is an important mechanism is nearly every cellular process. E3 ubiquitin ligases specify the substrate and catalyze the transfer from an E2 ubiquitin conjugating enzyme to that protein. Though E3 enzymes are a large and well-studied class of proteins, little is known about how the E3 catalyzes this transfer. We plan to interrogate the functional consequences of mutation at every amino acid of an E3 ligase. To this end, we have chosen to study the U-box domain of UBE4B and constructed a library of 1 million UBE4B mutants displayed on the coat of T7 phage. We use the UBE4B phage in in vitro ubiquitination reactions to test their E3 activity. With the addition of E1 and E2 enzymes, the UBE4B catalyzes autoubiquitination using Flag-tagged ubiquitin. This procedure allows us to select for enzymatically active UBE4B-phage by incubation with anti-Flag beads. Nonspecifically bound phage are washed away and bound phage are eluted by competition with Flag peptide. The eluted phage are amplified and subjected to more rounds of selection. Using high throughput sequencing to determine genotypes in the input pool of phage versus selected phages, we can track how each mutation performs during the selection experiments. This experiment will give us insight into the function of every amino acid in the U-box domain of UBE4B and may reveal the functional elements of E3 catalysis.
该副本是利用资源的众多研究子项目之一
由NIH/NCRR资助的中心赠款提供。对该子弹的主要支持
而且,副投影的主要研究员可能是其他来源提供的
包括其他NIH来源。 列出的总费用可能
代表subproject使用的中心基础架构的估计量,
NCRR赠款不直接向子弹或副本人员提供的直接资金。
泛素信号传导几乎是每个细胞过程。 E3泛素连接酶指定底物并催化从E2泛素结合酶转移到该蛋白质。 尽管E3酶是一种大型且研究良好的蛋白质,但对于E3如何催化这种转移,知之甚少。 我们计划在E3连接酶的每个氨基酸上询问突变的功能后果。 为此,我们选择研究UBE4B的U-box域,并在T7噬菌体上构建了100万个UBE4B突变体的库。 我们在体外泛素化反应中使用UBE4B噬菌体来测试其E3活性。 随着E1和E2酶的添加,UBE4B使用标记为标记的泛素催化自动嘌呤。 此过程使我们能够通过与抗Flag珠一起孵育来选择酶活性的UBE4B阶段。 将非特异性绑定的噬菌体洗净,并通过与国旗肽的竞争洗脱绑定的噬菌体。 洗脱的噬菌体被放大并进行更多的选择。 使用高吞吐量测序确定噬菌体输入库与所选噬菌体的基因型,我们可以跟踪每个突变在选择实验中的性能。 该实验将使我们深入了解UBE4B U盒域中每个氨基酸的功能,并可能揭示E3催化的功能元素。
项目成果
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专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
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