Identification of an endogenous AhR ligand and charcetrization of its mode of action

内源性 AhR 配体的鉴定及其作用模式的表征

基本信息

批准号：
22K19402
负责人：
成宮周
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

Aryl hydrocarbon receptor (AhR)は、dioxinやbenzpyreneなど芳香族炭化水素の受容体で、これらで活性化され、核に転移、チトクローム P450 などを誘導してこれらの代謝を促進する。AhRの働きは、dioxinの毒性発揮、benzopyreneの発がん性誘導、環境汚染物質による炎症惹起など生体に有害なことが多いが、これらはAhRの異物センサーとしての働きであり、遺伝子欠損マウスの解析からは、AhRが発生、細胞分化、抗炎症、免疫、生殖などに働くことが示されている。しかし、AhRがどのような内因性物質で活性化されこれらに働くのかは不明である。本研究の目的は、我々が培養ヒト表皮角化細胞（NHEK)の分化過程で見出した内因性のAhR活性化物質を同定し、その生理活性と発現メカニズムを解明することである。本年度は以下の研究を行った。1.チトクロームp450(CYP1A1)及び表皮角化細胞でAhR依存性に誘導されることが知られているfillagrin (FLG)の発現を指標にNHEK細胞を用いてAhR活性化物質を検出するassay系を確立した。２．上記を用いてNHEK細胞ライゼート及び培養上清のAhR活性化物質を検討し、細胞ライゼートのみならず培養上清でAhR活性化物質（CYP1A1及びFLG mRNA 誘導物質)を検出し、これがNHEK 培養にトリプトファン添加で増加することを確認した。また、各種阻害剤を用いることで、この活性がトリプトファンのキヌレニン経路によらないこと、また、IL-4添加と無関係であることを確認した。３. 量的に多い培養上清を用いて、活性をSepPAK C18で抽出、ついで、順相クロマト、逆相クロマトにかけ、活性がいくつかのピークに分かれること、それらの溶出位置を同定した。一部、質量分析にかけたが構造同定には至っていない。

芳基碳氢化合物受体（AhR）是二恶英、苯并芘等芳香族碳氢化合物的受体，被这些物质激活后，易位至细胞核，诱导细胞色素P450等，促进其代谢。 AhR的功能往往对生物体有害，如二恶英的毒性、苯并芘的致癌性、环境污染物诱发炎症等，但这些都是AhR作为异物传感器的功能，从基因分析来看-缺陷小鼠。已显示AhR在发育、细胞分化、抗炎、免疫、生殖等方面发挥作用。然而，尚不清楚哪些内源性物质激活 AhR 以及它如何作用于这些物质。本研究的目的是鉴定我们在培养的人表皮角质形成细胞（NHEK）分化过程中发现的内源性AhR激活剂，并阐明其生理活性和表达机制。今年，我们进行了以下研究。 1.建立了使用NHEK细胞检测AhR激活剂的测定系统，该系统使用已知在表皮角质形成细胞中以AhR依赖性方式诱导的细胞色素p450(CYP1A1)和填充蛋白(FLG)的表达作为指标。 2.使用上述方法，我们研究了NHEK细胞裂解液和培养上清液中的AhR激活剂，不仅在细胞裂解液中而且在培养上清液中检测到了AhR激活剂（CYP1A1和FLG mRNA诱导剂），证实了其量随着添加而增加。此外，通过使用各种抑制剂，我们证实这种活性不依赖于色氨酸犬尿氨酸途径，并且与IL-4的添加无关。 3.利用大量培养上清液，用SepPAK C18提取活性，然后进行正相层析和反相层析，将活性分成几个峰，并鉴定它们的洗脱位置。对其中的一部分进行了质谱分析，但未鉴定其结构。