神経細胞の軸索誘導における分子メカニズムの同定

神经元轴突引导分子机制的鉴定

• 批准号: 04F04712
• 负责人: 成宮 周
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04F04712/
• 关键词: 細胞・組織; 細胞遊走; 軸索ガイダンス; 小脳顆粒細胞; RNA干渉法; 走化性; 血小板由来成長因子; Cdc42; Rho; 初代培養; 小脳下流細胞; 胎児線維芽細胞

本研究では、繊維芽細胞の遊走・走化性に必要なシグナル分子がマウスの小脳顆粒細胞の遊走や軸索ガイダンスにも共通して重要であるかを解明することを目標とする。現在までに、それらの細胞系の初代培養手法を樹立した。単層培養グリア細胞上での小脳顆粒細胞の培養とともに、2次元ないし3次元における小脳顆粒細胞の分散培養や凝集培養での細胞動態が検討された。特に小脳顆粒細胞の凝集からの培養では、3次元のコラーゲンゲル内の培養でも2次元の培養でも印象的な神経突起伸長が観察された。引き続き解析には、蛍光顕微鏡での観察に適した後者の2次元培養を選択した。マウス胎児繊維芽細胞(MEF)については、心臓・肺・腎臓・体壁組織のうち、肺・体壁から単離したものが血小板由来成長因子(PDGF-BB)の濃度勾配に対して走化性を示したため、体壁由来のMEFを選択した。このように確立した初代培養系の走化性を観察するために、改良Dunn走化性チャンバーと多視野自動顕微鏡を用いたハイスループット観察系を樹立した。更に、RT-PCRによって、Cdc42サブファミリー(Cdc42,Tc10,Tcl,Chp)、Racサブファミリー(Rac1,2,3 and RhoG)のGTPアーゼがMEFに発現することを確認し、それらのcDNAを単離した。これらの分子の細胞遊走における役割や機能補完を解析する目的で、RNA干渉法を最適化した。現在のところ、Cdc42ノックダウンされたMEFが、細胞体の収縮とともに長く伸びた形態を示し、部分的な遊走の異常を示すことが観察された。しかしながら、走化性は保たれることから今まで重要と考えられてきたCdc42のシグナルとは別のシグナル機構が繊維芽細胞の走化性を制御することが示唆された。更に、今後Cdc42サブファミリーの2種の細胞系の遊走における役割を比較できるように、小脳顆粒細胞におけるRNA干渉法の最適化も行った。

本研究的目的是阐明成纤维细胞迁移和趋化性所需的信号分子对于小鼠小脑颗粒细胞的迁移和轴突引导是否也很重要。迄今为止，我们已经建立了这些细胞系的原代培养方法。除了在单层培养的神经胶质细胞上培养小脑颗粒细胞外，还研究了二维或三维分散和聚集培养物中小脑颗粒细胞的细胞动力学。特别是，在小脑颗粒细胞聚集体的培养物中，在 3D 胶原凝胶培养物和 2D 培养物中均观察到令人印象深刻的神经突生长。对于后续分析，我们选择了后者的二维培养物，其适合用荧光显微镜观察。从心脏、肺、肾和体壁组织中分离的小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）对血小板源性生长因子（PDGF-BB）的浓度梯度进行趋化，选择来自体壁的MEF，因为它们表现出相同的特性。 。为了观察由此建立的原代培养系统的趋化性，我们使用改良的Dunn趋化室和多视场自动显微镜建立了高通量观察系统。此外，我们通过RT-PCR确认了Cdc42亚家族（Cdc42、Tc10、Tcl、Chp）和Rac亚家族（Rac1,2,3和RhoG）的GTPase在MEF中表达，并分离了它们的cDNA。我们优化了RNA干扰方法来分析这些分子在细胞迁移中的作用和互补功能。到目前为止，我们观察到 Cdc42 敲低的 MEF 表现出细长的形态，伴有细胞体收缩和部分迁移异常。然而，趋化性得以维持，这表明迄今为止一直被认为很重要的Cdc42信号以外的信号机制控制着成纤维细胞趋化性。此外，我们还优化了小脑颗粒细胞中的RNA干扰方法，以便我们可以比较两个Cdc42亚家族细胞系在未来迁移中的作用。

项目成果

Using bioprobes to follow protein dynamics in living cells.

使用生物探针追踪活细胞中的蛋白质动态。

• 发表时间: 2004
• 作者: Holt; M.R.; Soong; D.Y.; Monypenny; J.et al.
• 通讯作者: J.et al.