ミスセンス変異体の安定性に注目したハイスループット機能評価系の開発

开发关注错义突变体稳定性的高通量功能评估系统

基本信息

批准号：
22K19488
负责人：
才津浩智
金额：
$ 4.08万
依托单位：
Hamamatsu University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

GFP融合ランダム変異体のハイスループット表現型スクリーニング1．ポジティブコントロールを用いたフローサイトメトリーの条件検討野生型のGFP-STXBP1を発現する発現ベクターと顕著な不安定性を有するGFP-STXBP1-Y84D変異体を発現するベクターを用いて、フローサイトメトリーで分取可能か条件検討を行った。別々にトランスフェクションし、その細胞を混ぜてフローサイトメトリーを行ったところ、内部発現コントロールのDsRedが陽性で、GFPが陰性である細胞（Y84D群）を明瞭に分取可能であった。しかしながら、2つのプラスミドを同時にトランスフェクションした場合、同一細胞に同時にトランスフェクションされるため、内部発現コントロールのDsRedが陽性で、GFPが陰性である細胞（Y84D群）が認められないという結果が得られた。この結果から、トランスフェクションは各クローン別々に行う必要があると考えられた。スループットを上げるために、各クローンのミニプレップは96サンプル処理が可能なキットを用いて行い、各クローンのGFP-STXBP1の発現量を評価後に、抽出したDNAを混合して配列決定を行うこととした。その際には、計画したショートリードとロングリードシークエンスの利点を生かした変異体の配列決定が可能である。2．変異体発現ベクターライブラリの作製計画通り、Diversify PCRランダム突然変異誘発キット（タカラバイオ）を用いてランダム変異導入を行った。どの程度の変異が入るかの確認を含めて、まず20クローンを単離し、このクローンをトランスフェクションしてGFP蛍光で安定性が評価できることを確認した。

GFP融合随机突变体的高通量表型筛选1.使用阳性对照检查流式细胞术的条件使用表达野生型 GFP-STXBP1 的表达载体和表达 GFP-STXBP1-Y84D 突变体的流式细胞术分离，我们检查了条件是否存在显着的不稳定性。可能的。当分别转染细胞并混合细胞并进行流式细胞术时，可以清楚地区分内部表达对照DsRed阳性的细胞和GFP阴性的细胞（Y84D组）。然而，当同时转染两个质粒时，同时转染相同的细胞，因此没有观察到内部表达对照DsRed呈阳性且GFP呈阴性的细胞（Y84D组）。根据该结果，认为需要分别转染各克隆。为了提高通量，使用能够处理96个样品的试剂盒对每个克隆进行小量制备，并在评估每个克隆的GFP-STXBP1的表达水平后，混合提取的DNA并进行测序。在这种情况下，可以利用计划的短读长和长读长测序来对突变体进行测序。 2.根据创建突变体表达载体库的计划，使用Diversify PCR随机诱变试剂盒(Takara Bio)引入随机突变。首先，分离出20个克隆，包括确认所涉及的突变程度，并确认可以通过使用GFP荧光转染这些克隆来评估稳定性。