Tef 遺伝子改変マウスを用いた関節リウマチ病態解析と創薬へのアプローチ

使用 Tef 基因修饰小鼠进行类风湿性关节炎病理分析和药物发现的方法

基本信息

批准号：
22K08563
负责人：
柱本照
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08563/
关键词：
関節リウマチ時計遺伝子時間生物学

项目摘要

(1)時計遺伝子転写因子Tefの発現をRNA干渉により抑制した関節リウマチ滑膜細胞（RA-FLS）をIL-6 /可溶性IL-6受容体(sIL-6R) (100ng/ml)、TNF-α(10ng/ml)で刺激した後、WST-8 法により細胞増殖活性を検討した。その結果、Tef発現抑制によりIL-6/sIL-6R 、TNF‐α刺激下でRA-FLSの細胞増殖活性が有意に上昇することを確認した。(2)野生型およびTef-/-マウス胚からマウス胎児線維芽細胞を単離し、WST-8法およびフォーカス形成法により細胞増殖活性を検討した。細胞増殖能の検証には、細胞培養液に含有するウシ血清を通常の10%から段階的に希釈して混和し、検討した。その結果、全ての血清濃度における細胞増殖活性がTef-/-細胞において亢進すること、また、10%血清含有下の通常条件で行った高密度細胞培養でのフォーカス形成能もTef-/- 細胞において上昇傾向を示すことがわかった。(3)野生型およびTef-/-マウス脾臓からmRNAを抽出し、リアルタイムPCR法にてTNF-α、IL-6のmRNA発現量を比較した。その結果、TNF-αのmRNA発現量はTef-/-マウス脾臓において上昇傾向を示した。(4)雌性Tef＋/＋マウスおよびTef＋/-マウスに、定法に従ってコラーゲン誘発関節炎を誘導した。関節炎の消長を観察し関節炎スコアを評価するともに、関節炎誘導実験開始後6週間後（第42日）に採血した血清を用いて、TNF-α、IL-6/17、IFNγ、MMP3、RANKL、OPGをELISA法により測定した。その結果、関節炎スコア、各血清評価指標ともTef＋/-マウスで増悪、あるいは上昇傾向であったものの、有意な差は見られなかった。

(1)用IL-6/可溶性IL-6受体(sIL-6R)(100ng/ml)处理通过RNA干扰抑制时钟基因转录因子Tef的表达的类风湿性关节炎滑膜细胞(RA-FLS)， TNF-α（10 ng/ml）刺激后，使用 WST-8 方法检查细胞增殖活性。结果，我们证实，在IL-6/sIL-6R和TNF-α刺激下，Tef表达的抑制显着增加了RA-FLS的细胞增殖活性。 (2)从野生型和Tef-/-小鼠胚胎中分离小鼠胎儿成纤维细胞，并使用WST-8法和焦点形成法检测细胞增殖活性。为了验证细胞增殖能力，将细胞培养基中所含的牛血清从通常的10%进行阶段稀释并混合。结果，所有血清浓度下Tef-/-细胞的细胞增殖活性均增强，并且在正常条件下10％血清含量的高密度细胞培养物中Tef-/-细胞形成灶的能力也增强。结果发现，有上升趋势(3)提取野生型和Tef-/-小鼠脾脏mRNA，实时荧光定量PCR比较TNF-α和IL-6 mRNA表达水平。结果，Tef-/-小鼠脾脏中TNF-α的mRNA表达水平呈现增加趋势。 (4)根据标准方法在雌性Tef+/+小鼠和Tef+/-小鼠中诱导胶原诱导的关节炎。除了观察关节炎的进展情况并评估关节炎评分外，在关节炎诱导实验开始后6周（第42天）收集血清用于评估TNF-α、IL-6/17、IFNγ、MMP3、RANKL ，OPG采用ELISA法测定。结果，尽管Tef+/-小鼠的关节炎评分和各血清评价指标有恶化或增加的倾向，但没有观察到显着差异。