ミトコンドリアDNA量制御の時間生物学モデルの開発

线粒体 DNA 含量控制的时间生物学模型的开发

• 批准号: 19K16033
• 负责人: 山口 碧
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K16033/
• 关键词: ミトコンドリアDNA; ミトコンドリアDNA量; マウス; CRISPR/Cas9; ミトコンドリア DNA; ミトコンドリア DNA量; コピー数変化; 時計遺伝子; 時間生物学

これまでに研究代表者は、経時的に採取したマウスの特定組織においてミトコンドリアDNA (mtDNA) の量およびmtDNAの複製に関わる遺伝子の発現が時間依存的に変化していること、また、組織によってその日内変動に差があることを分子生物学的解析により明らかにし、mtDNA量が分子時計による支配を受けていることが示唆された。そこでmtDNAの量の概日的制御機構に着目し、CRISPR/Cas9システムを用いた時計遺伝子欠損マウスの作製を試みた。昨年度に引き続き、十分な切断効率を有するguide RNA (gRNA) を選定し、Cas9ヌクレアーゼとgRNA複合体 (RNP) をエレクトロポレーション法にてマウス前核期受精卵に導入した後、二細胞期胚を偽妊娠雌マウスの卵管内に移植した。得られた産仔について、PCRとシークエンス解析により標的遺伝子の編集成否の確認を行った結果、変異個体が全く得られなかった。次に、標的を再設計し、人工合成した複数種類のgRNAおよびCas9タンパクをRNPとしてマウス前核期受精卵にエレクトロポレーションにより導入した。体外培養によって胚盤胞期胚まで発生させた後、PCRおよびシークエンス解析にて十分な切断効率を有するgRNAを選定した。続いて、同様の手順によりRNP導入後の2細胞期胚を偽妊娠雌マウスの卵管内に移植したが、全く産仔を得ることができなかった。現在、標的配列の再設計を行い、引き続きKOマウスおよびコンディショナルKOマウスの作製を計画している。

迄今为止，主要研究人员已经表明，随着时间的推移，在收集的小鼠特定组织中，线粒体DNA（mtDNA）的数量和参与mtDNA复制的基因的表达以时间依赖性方式发生变化，并且分子生物学分析表明，昼夜波动的差异，表明 mtDNA 含量受分子钟控制。因此，我们关注mtDNA数量的昼夜节律控制机制，并尝试利用CRISPR/Cas9系统创建时钟基因缺陷小鼠。延续去年的经验，我们选择了具有足够切割效率的指导RNA（gRNA），通过电穿孔将Cas9核酸酶和gRNA复合物（RNP）导入小鼠原核期受精卵中，然后将产生的两细胞期胚胎植入。假孕雌性小鼠的输卵管。通过PCR和序列分析确认在所得后代中编辑目标基因的成功或失败，结果没有获得突变个体。接下来，重新设计靶点，通过电穿孔将多种人工合成的gRNA和Cas9蛋白作为RNP导入小鼠原核期受精卵中。通过体外培养将胚胎发育至囊胚阶段后，通过PCR和序列分析选择具有足够切割效率的gRNA。随后，使用相同的程序将导入RNP后的二细胞期胚胎植入假孕雌性小鼠的输卵管中，但未能获得后代。目前我们正在重新设计靶序列，并计划继续生产KO小鼠和条件KO小鼠。