Elucidation of mechanism of inhibition by kinesin motor with structural and thermodynamic analyses and development of anticancer drugs

通过结构和热力学分析阐明驱动蛋白马达的抑制机制以及抗癌药物的开发

• 批准号: 22K06554
• 负责人: 横山 英志
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Tokyo University of Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06554/
• 关键词: キネシン; モータータンパク質; 結晶化; 構造解析; ATPアナログ; 構造; 熱分析; 抗がん剤

本研究では、X線結晶構造解析と熱分析（等温滴定型カロリメトリー）を主な手法として、細胞分裂期特異的なキネシンモータータンパク質であるCENP-Eとその阻害剤やATPアナログとの複合体構造を決定し、それら阻害剤による阻害の様式やATP加水分解の反応機構を解明することで、新規な抗がん剤を設計する構造基盤を得ることを目的とした。既存のタキサン、ビンカアルカロイドなどの微小管阻害剤と異なり、キネシンモーターの阻害剤は非分裂期の微小管には作用しないため、副作用の少ない抗がん剤のリード化合物として期待できる。初年度の令和4年度には、ヒトCENP-Eのモータードメイン（C末にHis tagを付与）の大量発現と精製の手法をすでに確立しているので、その手法で精製サンプルを得たのち、タンパク質発現時から含まれる内因性のヌクレオチド（ADP）を酵素apyraseを用いて加水分解して除去し、非加水分解性ATP アナログであるAMPPNPを添加した複合体の結晶を得、放射光施設（つくば高エネルギー加速器研究機構）にて1.9 Åと高分解能でX線回折強度データを収集し、分子置換法により構造解析を行った。得られた構造では、AMPPNPの電子密度が確認できた。このAMPPNP複合体構造を既に得られているADP複合体構造と比較することで構造変化を考察した。また本構造を、異なるファミリーのキネシンモータードメインのAMPPNNP複合体構造と比較することで、CENP-Eの特徴的な構造を考察した。構造の詳細について論文にまとめ投稿した。

本研究以X射线晶体学和热分析（等温滴定量热法）为主要方法，构建了细胞分裂特异性驱动蛋白动力蛋白CENP-E及其抑制剂和ATP类似物的复杂结构。通过确定这些抑制剂的抑制模式并阐明ATP水解的反应机制，为设计新的抗癌药物提供结构基础。与现有的微管抑制剂（例如紫杉烷类和长春花生物碱）不同，驱动蛋白运动抑制剂不作用于非有丝分裂微管，因此它们有望成为副作用很少的抗癌药物的先导化合物。在令和4元年，我们已经建立了人类CENP-E运动结构域（C末端带有His标签）的大规模表达和纯化方法，并在使用该方法获得纯化样品后，我们，使用腺苷三磷酸双磷酸酶将蛋白质表达过程中含有的内源核苷酸（ADP）水解并去除，并且去除不可水解的ATP。我们获得了含有模拟AMPPNP的复合物的晶体，在同步加速器辐射设施（筑波高能加速器研究组织）以1.9 Å的高分辨率收集了X射线衍射强度数据，并使用分子置换法进行了结构分析。塔。在得到的结构中，确认了AMPPNP的电子密度。通过将此 AMPPNP 复合物结构与先前获得的 ADP 复合物结构进行比较来考虑结构变化。此外，通过将该结构与不同家族的驱动蛋白运动结构域的AMPPNNP复合结构进行比较，我们考虑了CENP-E的特征结构。结构的细节总结在一篇论文中并提交。

项目成果

ネフローゼ症候群原因タンパク質podocinの調製と結晶化

肾病综合征蛋白podocin的制备及结晶

• 发表时间: 2022
• 作者: 安藤紘規;横山英志
• 通讯作者: 横山英志

Structural and mutational studies suggest key residues to determine whether stomatin SPFH domains form dimers or trimers

结构和突变研究表明关键残基可确定气孔蛋白 SPFH 结构域是否形成二聚体或三聚体

• DOI: 10.1016/j.bbrep.2022.101384
• 发表时间: 2022
• 影响因子: 2.7
• 作者: Komatsu Tomoya;Matsui Ikuo;Yokoyama Hideshi
• 通讯作者: Yokoyama Hideshi

ネフローゼ症候群原因タンパク質podocinの結晶化

Podocin（一种引起肾病综合征的蛋白质）的结晶

• 发表时间: 2023
• 作者: 安藤紘規;横山英志
• 通讯作者: 横山英志

Structural basis for peptide recognition by archaeal oligopeptide permease A

古菌寡肽通透酶 A 识别肽的结构基础

• DOI: 10.1002/prot.26324
• 发表时间: 2022
• 作者: Yokoyama Hideshi;Kamei Nanami;Konishi Keijiro;Hara Kodai;Ishikawa Yoshinobu;Matsui Ikuo;Forterre Patrick;Hashimoto Hiroshi
• 通讯作者: Hashimoto Hiroshi

キネシンCENP-Eモータードメインと阻害剤複合体の調製と結晶化

驱动蛋白CENP-E运动结构域和抑制剂复合物的制备和结晶

• 发表时间: 2022
• 作者: 鈴木翠;渋谷明日香;小郷尚久;澤田潤一;浅井章良;横山英志
• 通讯作者: 横山英志