Functional background of mitochondrial genome evolution unraveled from the atp8 gene of Polypedates leucomystax

从Polypedates leucomystax的atp8基因揭示线粒体基因组进化的功能背景

基本信息

批准号：
22K06348
负责人：
安岡有理
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

【計画１】ゲノム編集によるネッタイツメガエルMitoゲノム変異体の作出ヒトミトコンドリア局在配列がツメガエル細胞で十分機能することをツメガエル培養細胞で確認したのち、ミトコンドリア局在型Cas9とRP-loop付きsgRNAをツメガエル胚に顕微注入したが、ミトコンドリアゲノムに変異が導入された形跡は認められなかった。また、RP-loop配列のミトコンドリア局在に対する有効性を調べるためにヒト培養細胞やツメガエル培養細胞を用いたRNAトランスフェクション実験を行ったが、RP-loopなしでもミトコンドリア画分から大量のsgRNAが検出されてしまったので、実験系の再検討が必要となった。なお、抗Cox4抗体を用いることでツメガエルミトコンドリアを抗体染色にて可視化する方法も確立した。【計画２】MITO-Porterを用いたMitoゲノム遺伝子の機能解析ミトコンドリア用に遺伝子コードを改変したmVenus mRNAを作成し、MITO-Porterに封入してツメガエル胚に顕微注入したが、蛍光観察・ウェスタンブロッティングどちらでも発現を認められなかった。また、MITO-Porterに導入した蛍光色素を観察しても、明瞭なミトコンドリアへの局在は確認できなかった。【計画３】シロアゴガエル全ゲノム配列の解読一分子ロングリードシークエンサー（PacBio Sequel II HiFiリード）を用いて、シロアゴガエルの全ゲノム解読を行った結果、良好なゲノムアセンブリが得られた（Scaffod N50=1.46Mb, complete BUSCOs=94.8%）。トランスクリプトームデータと合わせて解析した結果、シロアゴガエルミトコンドリア関連遺伝子には目立った重複がないこと、atp8遺伝子が核に移行した形跡はないこと、これまで偽遺伝子だと思われてきたatp8が十分に転写されていることを明らかにした。

[计划1]通过基因组编辑创建埃及爪蟾Mito基因组突变体在培养的爪蟾细胞中确认人类线粒体定位序列在爪蟾细胞中发挥良好作用后，生成了线粒体定位的Cas9和带有RP环的sgRNA，尽管将其显微注射到爪蟾胚胎中，没有观察到线粒体基因组中引入突变的证据。此外，我们使用培养的人类细胞和培养的非洲爪蟾细胞进行RNA转染实验，以研究RP环序列对线粒体定位的有效性，但即使没有RP环，在线粒体部分中也检测到大量的sgRNA。，有必要重新考虑实验系统。我们还建立了一种通过使用抗 Cox4 抗体进行抗体染色来可视化非洲爪蟾线粒体的方法。 [计划2]使用MITO-Porter对Mito基因组基因进行功能分析我们创建了修改了线粒体遗传密码的mVenus mRNA，将其封装在MITO-Porter中，并将其显微注射到非洲爪蟾胚胎中荧光观察和蛋白质印迹未观察到表达。无论哪种情况。此外，即使观察导入MITO-Porter的荧光染料，也无法确认线粒体的明确定位。【方案三】破译白胡子蛙全基因组序列利用单分子长读长测序仪（PacBio Sequel II HiFi Read），我们对白胡子蛙全基因组进行了测序，得到了良好的基因组获得组装(Scaffod N50=1.46Mb)，完整的BUSCO=94.8%)。结合转录组数据分析，我们发现白胡子蛙线粒体相关基因没有明显重复，没有证据表明atp8基因已经迁移到细胞核，并且atp8已经迁移到细胞核中。曾被认为是假基因，后来发现转录是足够的。