転写因子Lhx1とLhx3に注目した脊椎動物原腸胚オーガナイザーの進化発生生物学的解析

以转录因子 Lhx1 和 Lhx3 为重点的脊椎动物原肠胚组织者的进化和发育生物学分析

基本信息

批准号：
09J02408
负责人：
安岡有理
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

1)エンハンサー比較解析ナメクジウオ(Branchiostoma belcheri)のgscの5'側領域のエンハンサー活性を、Xenopus胚を用いたトランスジェニックレポーター解析で調べた結果、レポーター遺伝子がナメクジウオ様の発現を示したことから、頭部オーガナイザーの進化におけるgscエンハンサーの進化が明らかになった。2)イソギンチャク胚でのLhx1過剰発現実験解析イソギンチャク(Nematostella vectensis)胚へのmRNA顕微注入実験を行った結果、蛍光タンパク質恥nusを融合したNematostella Lhx1強活性化型コンストラクト(共役因子Ldb・Ssbpとの融合コンストラクト)を発現させた胚で二次軸誘導が観察された。3)Gscおよびヒストン修飾のChIP-seq解析および遺伝子過剰発現胚のRNA-seq解析(i)ネッタイツメガエル原腸胚と、抗Gsc抗体、抗ヒストンH3K4me1抗体、抗ヒストンH3K27ac抗体を用いてChIP-seq解析を行った。その結果、GscとOtx2との協調的な遺伝子抑制機構や、Lhx1,Otx2,Gscの結合するシス制御領域のエピジェネティックな状態が明らかになった。(ii)ネッタイツメガエル胚にOtx2とTle1を帯域に過剰発現させたものを原腸胚で回収し、RNA-seq解析を行った。さらに、頭部オーガナイザーミックス(Lhx1,Otx2,Gsc,Ldb1,Ssbp3,Tle1)を背側もしくは腹側の帯域に発現させ、発現させた側を胚全体の約三分の一切り取り、RNA-seq解析を行った。加えて、原腸胚の帯域を外科的に切り取り、RNA-seqを行うことで、帯域に発現する遺伝子の網羅的同定を試みた。これらの結果から、原腸胚帯域における遺伝子発現制御機構がゲノムワイドに解析可能になった。

1) 增强子的比较分析我们通过使用非洲爪蟾胚胎的转基因报告基因分析研究了文昌鱼(Branchiostoma belcheri) gsc 5'区域的增强子活性，揭示了gsc增强子在分裂组织者进化中的进化。 2) 海葵胚胎中 Lhx1 过表达的实验分析通过对海葵 (Nematostella vectensis) 胚胎进行 mRNA 显微注射实验，我们发现 Nematostella Lhx1 强激活构建体与荧光蛋白 nus 融合（结合耦合因子 Ldb 和Ssbp)在表达融合构建体的胚胎中观察到次轴诱导。 3) Gsc 和组蛋白修饰的 ChIP-seq 分析以及基因过表达胚胎的 RNA-seq 分析 (i) 使用抗 Gsc 抗体、抗组蛋白 H3K4me1 抗体和抗组蛋白 H3K27ac 抗体对埃及爪蟾原肠胚胚胎进行 ChIP-seq 分析进行了 Seq 分析。结果揭示了Gsc和Otx2之间的协同基因抑制机制以及Lhx1、Otx2和Gsc结合的顺式调控区的表观遗传状态。 (ii)将条带中Otx2和Tle1过表达的埃及爪蟾胚胎回收为原肠胚胚胎并进行RNA-seq分析。此外，我们在背侧或腹侧区域表达头部组织者混合物（Lhx1、Otx2、Gsc、Ldb1、Ssbp3、Tle1），从表达的一侧切下整个胚胎的大约三分之一，并进行 RNA-seq我做了分析。此外，通过手术切除原肠胚区并进行RNA-seq，我们试图全面鉴定该区域表达的基因。这些结果使得在全基因组基础上分析原肠胚区的基因表达控制机制成为可能。