原口から脊索を生み出した進化過程のＣｈＩＰ－ｓｅｑ法を用いた解析

使用 ChIP-seq 方法分析从胚孔产生脊索的进化过程

基本信息

批准号：
12J09531
负责人：
安岡有理
金额：
$ 2.32万
依托单位：
Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J09531/
关键词：
脊索原口進化発生転写制御 brachyury ChIP-seq RNA-seq

项目摘要

１）サンゴ胚に薬剤処理を施し、Wnt/β-cateninシグナルを活性化したところ、brachyuryの発現が活性化され、外胚葉全体に発現が広がった。一方、Wnt/β-cateninシグナルを抑制したところ、brachyuryの発現が弱まるもしくは消失した。さらに、サンゴbrachyuryの上流約1 kbをクローニングし、Xenopus胚を用いてLuciferase reporter assayを行った結果、サンゴTcfによってレポーターの発現が制御されることが示された。２）Xenopus特異的な二つのbrachyuryパラログ遺伝子brachyury（主に尾芽に発現）およびbrachyury2（主に脊索に発現）のエンハンサー候補配列の活性について、トランスジェニックレポーター解析を行った。その結果、brachyury U1領域は脊索とともに体節でもエンハンサー活性を持つが、U2領域と組み合わせることで体節でのレポーター遺伝子の発現は弱まり、脊索での発現がより顕著になることが示された。一方、brachyury2のU1領域は体節でのエンハンサー活性が弱く、脊索でのエンハンサー活性が強かった。このU1領域の活性の違いが、二つの遺伝子機能の分化に寄与した可能性が高い。さらに、各brachyury機能阻害胚のRNA-seq解析を行った結果、Brachyury2特異的な標的遺伝子候補として、脊索細胞の液胞化や細胞形態に関わる遺伝子が多く見つかった。３）サンゴbrachyuryの機能阻害胚を用いたRNA-seq解析の結果同定された標的遺伝子候補のうち、brachyury機能阻害胚で発現の減少した遺伝子は原腸胚期で主に外胚葉で発現しており、逆に機能阻害胚で発現が増加した遺伝子は内胚葉で発現することが示された。これは、サンゴBrachyuryが原口において外胚葉と内胚葉の分化のバランスを制御していることを示唆している。４）Xenopus Brachyury2およびホヤBrachyuryの抗原を精製するため、FLAGタグを用いたところ、これまでのGST融合タンパク質よりも安定して大腸菌内で発現させられることがわかった。

1）当用药物处理珊瑚胚胎以激活Wnt/β-catenin信号时，brachyury表达被激活并扩散到整个外胚层。另一方面，当Wnt/β-连环蛋白信号被抑制时，brachyury表达减弱或消失。此外，我们克隆了珊瑚brachyury上游约1 kb，并使用非洲爪蟾胚胎进行荧光素酶报告基因检测，结果表明报告基因表达受到珊瑚Tcf的调节。 2)对非洲爪蟾特异性brachyury旁系同源基因brachyury（主要在尾芽中表达）和brachyury2（主要在脊索中表达）的增强子候选序列的活性进行转基因报告基因分析。结果表明，brachyury U1区域在脊索和体节中均具有增强子活性，但当与U2区域结合时，报告基因在体节中的表达减弱，在脊索中的表达变得更加明显。另一方面，brachyury2的U1区域在体节中具有弱增强子活性，在脊索中具有强增强子活性。 U1 区域活性的差异很可能导致了两个基因功能的差异。此外，对每个 Brachyury 功能抑制胚胎进行 RNA-seq 分析的结果，发现许多参与脊索细胞空泡化和细胞形态的基因作为候选 Brachyury2 特异性靶基因。 3)在使用珊瑚brachyury功能抑制胚胎进行RNA-seq分析而鉴定出的候选靶基因中，在brachyury功能抑制胚胎中表达降低的基因主要在原肠胚阶段的外胚层中表达，相反，在原肠胚阶段表达降低的基因。功能抑制胚胎的增加在内胚层中表达。这表明珊瑚 Brachyury 控制胚孔处外胚层和内胚层分化之间的平衡。 4）当我们使用FLAG标签纯化Xenopus Brachyury2和Ascidian Brachyury抗原时，我们发现它们比传统的GST融合蛋白能够在大肠杆菌中更稳定地表达。

项目成果

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会议论文数量（0）

专利数量（0）

Massively parallel regulation of head and non-head genes by Otx2, Lim1 and Gsc underlies the evolution of the head organizer in the chordate

Otx2、Lim1 和 Gsc 对头部和非头部基因的大规模并行调控是脊索动物头部组织者进化的基础

DOI：
发表时间：
2012
期刊：
影响因子：
0
作者：
Yuuri Yasuoka; Yutaka Suzuki; Shuji Takahashi; Norihiro Sudou; Yoshikazu Haramoto; Yukiko T;ou; Kaoru Kubokawa; Ken W. Cho; Makoto Asashima; Sumio Sugano; Masanori Taira
通讯作者：
Masanori Taira

Occupancy of tissue-specific cis-regulatory modules by Otx2 and TLE/Groucho for embryonic head specification.

Otx2 和 TLE/Groucho 占用组织特异性顺式调节模块以实现胚胎头部规范。

DOI：
10.1038/ncomms5322
发表时间：
2014
期刊：
影响因子：
16.6
作者：
Yasuoka Y; Suzuki Y; Takahashi S; Someya H; Sudou N; Haramoto Y; Cho KW; Asashima M; Sugano S; Taira M.
通讯作者：
Taira M.

Head specification mediated by Otx2 partner with Lim1 or Gsc and control expression of thousands of target genes in a massively parallel fashion

Otx2 介导的头部规范与 Lim1 或 Gsc 配合，以大规模并行方式控制数千个靶基因的表达

DOI：
发表时间：
2012
期刊：
影响因子：
0
作者：
Yuuri Yasuoka; Yutaka Suzuki; Shuji Takahashi; Norihiro Sudou; Yoshikazu Haramoto; Ken W. Cho; Makoto Asashima; Sumio Sugano; Masanori Taira
通讯作者：
Masanori Taira

ChIP-Seq analysis of Transcription factor Siamois for mechani sms of head organizer formation, 転写因子SiamoisのChIP-Seq解析による頭部オーガナイザー形成機構の解明

对转录因子 Siamois 进行 ChIP-Seq 分析以了解头部组织者形成机制，通过转录因子 Siamois 的 ChIP-Seq 分析阐明头部组织者形成机制