Characterization of the unique Fe-S-O metallocluster of HCP enzyme

HCP 酶独特的 Fe-S-O 金属簇的表征

基本信息

批准号：
22K05137
负责人：
藤城貴史
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Saitama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

2022年度では、HCPの触媒機構解明に必要不可欠となる、高分解能X線結晶構造を与えるHCPの探索を行った。様々な嫌気性微生物由来のHCPを、His-tagを持つ大腸菌組換え酵素として発現するためのプラスミドをそれぞれ構築し、嫌気的に発現、精製、結晶化を行った。その結果、異なる３種の微生物由来のHCPの結晶が得られた。放射光施設Photon factory、Swiss Light Source、SPring-8などでそれらのX線結晶回折データを収集し、XDSによるデータ処理、Molrepを用いた分子置換法による位相決定とCootによる構造モデリング、Refmac5による構造精密化を行なった。構造決定したHCPのうち、ある1つの微生物種由来のHCPが、その活性部位の特徴的な無機クラスターの原子座標、ならびに、その構成元素の種類を判別可能な高分解能で構造決定された。この構造では、活性部位のhybrid clusterが、以前に報告された[4Fe-2S-3O]型の休止状態のクラスターであること、そして、その配位子となるアミノ酸が同じ位置に高度に保存されていることが明らかとなった。また、配位子の1つのシステインは、システインペルスルフィドの形をとっており、これも以前のHCPの休止状態の結晶構造での報告例と一致した。これまでの報告例にあるHCPは全て本来の宿主由来のnativeタンパク質、または同種生物由来組み換え体発現系を用いているが、今回の実験で、異種生物由来のHCPを大腸菌で大量に得る系を確立できた。

在2022财年，我们寻找能够提供高分辨率X射线晶体结构的HCP，这对于阐明HCP的催化机制至关重要。我们构建了质粒来表达来自各种厌氧微生物的 HCP，作为带有 His 标签的大肠杆菌重组酶，并进行厌氧表达、纯化和结晶。结果，获得了源自三种不同微生物的HCP晶体。我们在同步加速器辐射设施（例如 Photon 工厂、Swiss Light Source 和 SPring-8）收集了 X 射线晶体衍射数据，并使用 XDS 处理数据，使用 Molrep 分子置换法确定相位，使用 Coot 进行结构建模，并使用 Coot 进行结构建模。 Refmac5。在已确定结构的 HCP 中，以高分辨率确定了源自微生物物种的 HCP 的结构，从而可以确定其活性位点中特征无机簇的原子坐标及其组成元素的类型。该结构表明，活性位点杂合簇是先前报道的[4Fe-2S-3O]型休眠簇，并且其配体氨基酸在相同位置上高度保守。此外，配体之一半胱氨酸为半胱氨酸过硫化物的形式，这也与之前报道的HCP静息态晶体结构一致。迄今为止报道的所有 HCP 均使用源自原始宿主的天然蛋白或源自同源生物的重组表达系统，但在本实验中，我们开发了一个系统，能够使用大肠杆菌获得大量源自异源生物的 HCP。来建立它。