Elucidation of the mechanism by which tRNA thiolation enzymes with iron-sulfur clusters regulate two different reactions

阐明具有铁硫簇的 tRNA 硫醇化酶调节两种不同反应的机制

基本信息

批准号：
21J12999
负责人：
石坂優人
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は昨年度、2-チオウリジン合成酵素TtuAに結合した鉄硫黄クラスター構造とTtuAの酵素活性を経時的に相関解析し、活性型TtuAは[4Fe-4S]鉄硫黄クラスターのみ持つことを明らかにした。今年度は、これらの結果を査読あり国際誌International Journal of Molecular Sciences誌に発表するとともに、TtuAのtRNA活性化機構（アデニル化tRNA合成機構）の解明を目指した。TtuA-tRNA複合体の精製は困難だったため、TtuAの結晶に基質塩基5-メチルウリジン（m5s2U）またはUMP、さらにATPをソーキングし、X線結晶構造解析に取り組んだ。その結果、分解能2.5 Å程度で[4Fe-4S]-TtuAとATPまたはADPとの複合体の電子密度を得た。これらの構造は、TtuAがATPをADPに加水分解し、tRNA活性化に利用する可能性を示唆している。一方で、ATPを利用した時のTtuAの酵素活性（m5s2U合成活性）に比べ、ADPを利用した時の酵素活性は約3割しかなかった。したがって、tRNA活性化にATPが直接使われるか、ADPが使われるかを明らかにするためには、さらなる研究が必要である。次に我々は、TtuAと基質塩基との相互作用様式を明らかにするために、tRNAリシジン合成酵素TilS-tRNA複合体の構造に基づき、TtuA-m5s2U-ATP複合体のモデル構造を構築した。さらに、このモデル構造に基づいて8種類の変異体を作成し、HPLCでTtuAの酵素活性を解析した。その結果、R138A変異体の酵素活性が完全に消失した。我々のモデル構造では、Arg138はm5s2Uのリン酸基と相互作用しており、TtuAファミリー内で完全に保存されている。したがって我々は、Arg138がTtuA-tRNA複合体形成に必須であると結論付けた。

去年，我们对2-硫尿苷合酶TtuA结合的铁硫簇结构与TtuA的酶活性进行了时间依赖性相关分析，发现TtuA的活性形式仅具有[4Fe-4S]铁-硫簇。今年，我们将这些结果发表在同行评审的国际期刊《国际分子科学杂志》上，旨在阐明 TtuA 的 tRNA 激活机制（腺苷酸化 tRNA 合成机制）。由于纯化 TtuA-tRNA 复合物比较困难，我们将 TtuA 晶体浸泡在底物 5-甲基尿苷 (m5s2U) 或 UMP 中，然后浸泡在 ATP 中进行 X 射线晶体结构分析。结果，以约2.5 Å的分辨率获得了[4Fe-4S]-TtuA与ATP或ADP复合物的电子密度。这些结构表明 TtuA 可能会将 ATP 水解为 ADP 并将其用于 tRNA 激活。另一方面，与使用ATP时的TtuA的酶活性(m5s2U合成活性)相比，使用ADP时的酶活性仅为约30%。因此，需要进一步的研究来阐明ATP或ADP是否直接用于tRNA激活。接下来，我们基于tRNA赖氨酸合酶TilS-tRNA复合物的结构构建了TtuA-m5s2U-ATP复合物的模型结构，以阐明TtuA与底物碱基之间的相互作用模式。此外，基于该模型结构创建了八种突变体，并通过HPLC分析了TtuA的酶活性。结果，R138A突变体的酶活性完全消失。在我们的模型结构中，Arg138 与 m5s2U 的磷酸基团相互作用，并且在 TtuA 家族中完全保守。因此我们得出结论，Arg138 对于 TtuA-tRNA 复合物的形成至关重要。