フッ素化分子の特異な電子構造を基盤とするヘム酵素の反応空間設計と触媒機能制御

基于氟化分子独特电子结构的血红素酶反应空间设计及催化功能控制

• 批准号: 08J05035
• 负责人: 藤城 貴史
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J05035/
• 关键词: シトクロムP450; ヘム; 過酸化水素; 酸化; タンパク質工学; X線結晶構造解析; フッ素; 酵素; 人工酵素; タンパク質の修飾; 不斉; 構造計算; 不斉酸化; 反応空間

本年度は,擬似基質を利用する手法の一般性を検証するため,シトクロムP450_<BSβ>(P450_<BSβ>)と44%のアミノ酸相同性を示すシトクロムP450_<SPα>(P450_<SPα>)の利用を検討した.P450_<SPα>のX線結晶構造解析に成功し,P450_<BSβ>と共通の酸化活性種生成機構が,P450_<SPα>にも保存されていることを確認した.P450_<SPα>による非天然基質であるスチレンのエポキシ化反応を,直鎖状のアルキル鎖の短いカルボン酸を擬似基質として用いて行った結果,同じカルボン酸存在下でも,P450_<SPα>とP450_<BSβ>では,反応の不斉選択性が逆転することが明らかとなった.一方、直鎖状のパーフルオロカルボン酸を用いた場合は,P450_<SPα>とP450_<BSβ>のどちらも全く触媒活性を示さなかった.また,興味深いことに,P450_<SPα>にα位にキラル中心を持つカルボン酸を擬似基質として用いると,擬似基質のキラリティーの違いのみで,不斉選択性が反転する現象を見いだした.高いS選択性へと不斉選択性を変化させた(R)-イブプロフェンと野生型P450_<SPα>との共結晶のX線結晶構造解析により,α位のメチル基がスチレン分子の結合に与える影響について原子レベルで明らかとした.一方,システインへの特異的化学修飾反応を利用し,P450_<SPα>の反応空間にフッ素原子を有する有機分子を導入した場合についても,擬似基質を用いたスチレンのエポキシ化反応を行った.同じ擬似基質を用いた場合で比較した結果,反応活性,不斉選択性ともに,修飾前の方がより高いことが明らかとなった.以上の結果から,擬似基質を用いる本手法は,酵素の共有結合による化学修飾を必要とせず,触媒活性や不斉選択性を簡便に制御・変換可能とする新規酵素機能改変法として,今後の利用が期待される.

今年，为了验证使用伪底物的方法的通用性，我们将利用细胞色素 P450_<SPα> (P450_<SPα>)，它与细胞色素 P450_<BSβ> (P450_<BSβ>) 具有 44% 的氨基酸同源性。我们成功分析了 P450_<SPα> 的 X 射线晶体结构，并证实与 P450_<BSβ> 相同的氧化活性物质生成机制在非天然底物的 P450_<SPα> 中也保守。使用具有短直链烷基链的羧酸作为拟底物进行特定的苯乙烯环氧化反应，结果发现即使在相同的羧酸存在下，P450_<SPα>和P450_<BSβ>也表现出不对称反应发生逆转。另一方面，当使用直链全氟羧酸时，P450_<SPα>和P450_<BSβ>均未表现出任何催化活性。有趣的是，P450_α位置对<SPα>当使用具有手性中心的羧酸作为假底物时，我们发现仅仅由于假底物的手性差异，手性选择性就发生逆转。不对称选择性变为高S选择性(R)-布洛芬和。野生型P4通过对 50_<SPα> 共晶的 X 射线晶体结构分析，我们在原子水平上阐明了 α 位甲基对苯乙烯分子键合的影响。当将含有氟原子的有机分子引入反应空间时，也可以使用假基质进行苯乙烯的环氧化反应。通过比较使用相同假基质的情况，反应活性和不对称性均得到提高。选择性较改性前更高。从以上结果来看，这种使用假底物的方法不需要通过共价键对酶进行化学修饰，并且可以容易地控制和转换酶的催化活性和手性选择性，该方法有望用于。未来作为修改功能的方法。

项目成果

Regulation mechanism of H_2O_2 access to the heme cavity in cytochrome P450_

H_2O_2进入细胞色素P450_<BSβ>血红素腔的调控机制

• 发表时间: 2009
• 作者: T.Fujishiro; O.Shoji; S.Tanaka; S.Nagano; Y.Shiro; Y.Watanabe
• 通讯作者: Y.Watanabe

外部添加因子を用いた過酸化水素駆動型シトクロムP450の基質特異性の変換と不斉選択性の制御

使用外部添加因子转换底物特异性并控制过氧化氢驱动的细胞色素 P450 的手性选择性

• 发表时间: 2009
• 作者: 藤城貴史;荘司長三;田中翔太;永野真吾;城宜嗣;渡辺芳人
• 通讯作者: 渡辺芳人

過酸化水素駆動型シトクロムP450_のX線結晶構造解析

过氧化氢驱动的细胞色素 P450_<SPα> 的 X 射线晶体结构分析

• 发表时间: 2010
• 作者: 藤城貴史;荘司長三;渡邉貴大;中島洋;杉本宏;永野真吾;城宜嗣;渡辺芳人
• 通讯作者: 渡辺芳人

Crystal Structure of H_2O_2-dependent Cytochrome P450_ from Sphingomonas paucimobilis (CYP152B1)

少动鞘氨醇单胞菌 (CYP152B1) H_2O_2 依赖性细胞色素 P450_<SPα> 的晶体结构

• 发表时间: 2010
• 作者: Takashi Fujishiro; Osami Shoji; Takahiro Watanabe; Hiroshi Sugimoto; Shingo Nagano; Yoshitsugu Shiro; Yoshihito Watanabe
• 通讯作者: Yoshihito Watanabe

X-ray Crystal Structure Analysis of Hydrogen Peroxide-dependent Cytochrome P450_ and Its Application in Oxidation of Non-natural Substrates

过氧化氢依赖性细胞色素P450_<SPα>的X射线晶体结构分析及其在非天然底物氧化中的应用

• 发表时间: 2010
• 作者: Takashi Fujishiro; Osami Shoji; Takahiro Watanabe; Hiroshi Nakajima; Hiroshi Sugimoto; Shingo Nagano; Yoshitsugu Shiro; Yoshihito Watanabe
• 通讯作者: Yoshihito Watanabe