Structural basis of the iron-sulfur cluster biogenesis, and the establishment of ex-situ reconstitution system

铁硫团簇生物发生的结构基础及异位重构体系的建立

基本信息

批准号：
20H03196
负责人：
和田啓
金额：
$ 11.4万
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

鉄硫黄クラスター(Fe-S)は、酸素に脆弱なタンパク質コファクターである。Fe-Sクラスターは単純な構造だが、この生合成にはSUFマシナリーと呼ばれる大掛かりな蛋白質群を必要とする。本研究課題ではその"心臓部"といえるSufBCD複合体に焦点をあてる。この複合体は ATP 加水分解に共役して、鉄と硫黄原子をFe-Sクラスターへ変換する。本研究の目的は、酸素に不安定なFe-Sクラスター合成超複合体の作動メカニズムの全容解明である。また、窒素条件および低酸素条件を感知するタンパク質CnfRに関して、構造機能解析を進める。本年度は以下の項目を実施した。(i)合成途上Fe-Sクラスター結合状態のSufBCD複合体の大量精製および結晶化スクリーニング：無酸素チャンバー内で精製することで、Fe-Sクラスター結合状態のコア複合体を得ることができている。無酸素条件下で稼働しているロボットを用いて、結晶化条件スクリーニングを行った。ATPアナログなどの添加剤、タンパク質濃度、温度など、これまでに7000条件以上のスクリーニングを実施した。得られた微結晶に関しては、大型放射光施設SPring-8にて回折能のチェックを行った。(ii)SufBCD複合体の構造変化状態の補足：これまでの成果により、SufBCD複合体に変異を導入し、ATPおよび酸化剤存在下において複合体の構造変化をロックすることに成功している。この変異SufBCD複合体をもちいて構造変化をロックした状態でのクライオ電子顕微鏡解析（東北大学）を進め、粒子動画の収集を完了した。(iii) 窒素固定のマスターレギュレーターCnfRの構造解析: 精製したCnfRの結晶化スクリーニングを行い、微結晶を得ることができた。大型放射光施設SPring-8にて、得られた結晶の回折能のチェックを行った。

铁硫簇 (Fe-S) 是氧敏感蛋白辅助因子。虽然Fe-S簇结构简单，但其生物合成需要一大群称为SUF机制的蛋白质。在这个研究项目中，我们将重点关注被称为“心脏”的SufBCD复合物。该复合物与 ATP 水解相结合，将铁和硫原子转化为 Fe-S 簇。本研究的目的是充分阐明氧不稳定的Fe-S簇合成超复合物的运行机制。我们还将继续对 CnfR（一种感知氮和缺氧条件的蛋白质）进行结构和功能分析。今年，我们落实了以下几项工作。 (i)合成过程中Fe-S簇结合态的SufBCD配合物的大规模纯化和结晶筛选：通过在无氧室中纯化，可以获得Fe-S簇结合态的核心配合物。使用在缺氧条件下操作的机器人筛选结晶条件。迄今为止，我们已经筛选了 7,000 多个条件，包括 ATP 类似物、蛋白质浓度和温度等添加剂。在大型同步辐射装置SPring-8中检查了所获得的微晶体的衍射功率。（ii）关于SufBCD复合物结构变化的补充信息：根据迄今为止获得的结果，我们成功地将突变引入SufBCD复合物中，并在ATP和氧化剂存在下锁定了复合物的结构变化。利用这种突变体SufBCD复合物，我们进行了冷冻电子显微镜分析（东北大学），锁定了结构变化，并完成了粒子视频的收集。 (iii)固氮主调节剂CnfR的结构分析：我们对纯化的CnfR进行了结晶筛选，并获得了微晶。在大型同步加速器辐射装置SPring-8中检查了所得晶体的衍射能力。

项目成果

期刊论文数量（25）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Evidence for dynamic in vivo interconversion of the conformational states of IscU during iron?sulfur cluster biosynthesis

铁硫簇生物合成过程中 IscU 构象状态动态体内相互转化的证据

DOI：
10.1111/mmi.14646
发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
3.6
作者：
Sato Sakiko;Matsushima Yumeka;Kanazawa Miaki;Tanaka Naoyuki;Fujishiro Takashi;Kunichika Kouhei;Nakamura Ryosuke;Tomioka Hiroaki;Wada Kei;Takahashi Yasuhiro
通讯作者：
Takahashi Yasuhiro

産業・創薬展開を目指した微生物由来グルタチオン分解酵素の立体構造解析

用于工业和药物发现开发的微生物谷胱甘肽降解酶的三维结构分析

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
和田　啓
通讯作者：
和田　啓

鉄硫黄クラスター生合成マシナリーの構造・機能解析

铁硫簇生物合成机制的结构和功能分析

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
和田啓
通讯作者：
和田啓

Structural basis of the protochromic green/red photocycle of the chromatic acclimation sensor RcaE

色适应传感器 RcaE 的原色绿/红光循环的结构基础

DOI：
10.1073/pnas.2024583118
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
Takayuki Nagae; Masashi Unno; Taiki Koizumi; Yohei Miyanoiri; Tomotsumi Fujisawa; Kento Masui; Takanari Kamo; Kei Wada; Toshihiko Eki; Yutaka Ito; Yuu Hirose; Masaki Mishima
通讯作者：
Masaki Mishima

多成分酵素系SUFマシナリーによる鉄硫黄クラスターの生合成

使用多组分酶基 SUF 机械生物合成铁硫簇