Cryo-EM structure of the ghrelin receptor coupled to an engineered heterotrimeric G protein

与工程化异三聚体 G 蛋白偶联的生长素释放肽受体的冷冻电镜结构

• 批准号: 20KK0359
• 负责人: 椎村 祐樹
• 金额: $ 8.99万
• 依托单位: Kurume University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (A))
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021 至 2023
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20KK0359/
• 关键词: グレリン受容体; GPCR; Cryo-EM; 立体構造

本年度は、アナモレリンが結合したグレリン受容体の構造解析を中心に研究を進めた。これまでの研究で良好な精製タンパク質粒子が得られていることがわかっていたので、大阪大学の300 keV電子顕微鏡Kriosでサンプル粒子を取得した。画像解析の結果、2.9オングストローム分解能で構造決定することができた。さらに得られた構造情報をもとにアナモレリンから4オングストローム以内にあるグレリン受容体の17のアミノ酸を抽出してアラニンに変異させた。このグレリン受容体変異体を用いてアナモレリン添加時のカルシウムシグナル活性を測定することにより結合に重要なアミノ酸の同定を試みた。その結果、Asp99、Arg102、Lue103、Gln120、Glu124、Ile178、Phe279、Arg283、Phe286、Asn305およびPhe309といった複数のアミノ酸点変異体でシグナル活性の減弱が確認された。次にアナモレリン結合構造と構造既知のグレリン受容体と比較したところ、アゴニストであるグレリンやイブタモレン、GHRP6結合構造と構造上の違いはほとんど見られず、構造新規性は低かった。そこで、渡米中に知り合ったSanford Researchの増保先生にお願いして、BRET活性によるシグナルアッセイを行って頂いた。増保先生のシグナルアッセイ系では、構造変化に起因するシグナル変化を測定することができる。その結果、アナモレリンは内因性アゴニストであるグレリンよりも作用の強い、「スーパーアゴニスト」であることがわかり、現在、論文執筆中である。

今年，我们专注于结合原蛋白蛋白结合的生长素蛋白受体的结构分析。先前的研究表明，已经获得了良好的纯化蛋白质颗粒，因此使用大阪大学的300 keV电子显微镜Krios获得了样品颗粒。图像分析表明，该结构是以2.9埃埃斯特罗姆斯分辨率确定的。此外，基于获得的结构信息，将17个氨基酸受体的17个氨基酸萃取并突变为丙氨酸。使用这种生长素受体突变体，我们试图通过在添加Anamorelin时测量钙信号活性来鉴定对结合重要的氨基酸。结果，在多个氨基酸点突变体中降低了信号活性，例如ASP99，ARG102，LUE103，GLN120，GLU124，ILE178，PHE279，ARG283，PHE286，ASN305和PHE309。接下来，当将Anamorelin结合结构与已知结构进行比较时，激动剂Ghrelin，Ibutamorene和GHRP6结合结构之间几乎没有结构差异，而结构新颖性很低。因此，我要求我在美国时遇到的桑福德研究教授，使用BRET活动进行信号测定。 Masuho的信号测定系统允许测量由结构变化引起的信号变化。结果，发现Anamorelin是一种“超级机动学家”，其作用比内源性激动剂发芽素更强，目前正在撰写论文。

项目成果

The cryo-EM structure of an agonist bound ghrelin receptor

激动剂结合的生长素释放肽受体的冷冻电镜结构

• 发表时间: 2022
• 作者: 椎村祐樹;林到炫;朝田秀基;岩田想;児島将康
• 通讯作者: 児島将康

Structure of an antagonist-bound ghrelin receptor

拮抗剂结合的生长素释放肽受体的结构

• 发表时间: 2022
• 作者: Shiimura Yuki;Horita Shoichiro;Hamamoto Akie;Asada Hidetsugu;Hirata Kunio;Mori Kenji;Kobayashi Takuya;Iwata So;Kojima Masayasu
• 通讯作者: Kojima Masayasu

循環器内科

心脏病学

• 发表时间: 2019
• 作者: 廣野恵一;市田蕗子;市田蕗子;市田蕗子;市田蕗子;市田蕗子;市田蕗子;市田蕗子
• 通讯作者: 市田蕗子

Insights Into the Regulation of Offspring Growth by Maternally Derived Ghrelin.

• DOI: 10.3389/fendo.2022.852636
• 发表时间: 2022
• 期刊: Frontiers in endocrinology
• 影响因子: 5.2
• 作者: Sato T;Ida T;Shiimura Y;Matsui K;Oishi K;Kojima M
• 通讯作者: Kojima M