部位特異的変異法によるNO合成酵素の電子移動機構と酸素分子活性化機構の解明

利用定点诱变阐明NO合酶的电子转移机制和氧分子激活机制

基本信息

批准号：
10129201
负责人：
清水透
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

生体内において極めて重要な働きをする伝達物質、一酸化窒素NO、をアルギニンから合成する神経型NO合成酵素(以下NOSと略す)の構造一機能相関、特に電子伝達及び酸素分子活性化の機構について研究した。1. NOSはL-Argから2段階の一酸素添加反応を経てNOを合成する。NOSはP450型ヘムを活性部位に保持している。NOSにおいても、P450と同様にAsp/Glu及びThrがO-O解裂に関与しているのではないかと考えて、神経型NOSで良く保存されたAsp314,Thr315を変異させて、それら変異体の反応活性を調べた。これら変異体の反応活性はP450の対応する変異体の挙動と非常に良く似たものであった。2. 神経型NOSの自動酸化速度を始めて測定した。自動酸化速度は3相より成っていた。この速度は、誘導型NOSの酸化酵素ドメインの自動酸化速度にくらべて2桁速かった。基質のL-Argやそれに類似した阻害剤の添加によって、特に、第1相及び第2相の酸化速度は著しく低下した。プテリンは第2相の割合を著しく増加させた。いっぽう、プテリンの存在下、基質や阻害剤によって酸化速度は変化しなかったが、反応中間体であるOH-L-Argによって第1相の酸化速度は著しく低下した。これらのことより、(1)L-Argは酸素結合型NOSを安定化する。(2)プテリンは酸素結合型NOSの自動酸化速度に影響を与えるが、その効果は、基質、阻害剤、中間体とは異なる。(3)中間体は自動酸化速度に基質とは異なる効果を与える。が示唆された。

对由精氨酸合成在体内起着极其重要作用的一氧化氮NO这一递质的神经元NO合酶（以下简称NOS）的结构-功能关系，特别是电子传递和氧分子活化的机制进行了研究。 1. NOS通过两步氧加成反应从L-Arg合成NO。 NOS 在其活性位点保留 P450 型血红素。考虑到Asp/Glu和Thr可能与P450一样参与NOS中的O-O裂解，我们对神经元NOS中保守的Asp314和Thr315进行了突变，并对这些突变体的反应活性进行了检查。这些突变体的活性与 P450 相应突变体的行为非常相似。 2.我们首次测量了神经元NOS的自氧化速率。自氧化速率由三个阶段组成。该速率比诱导型 NOS 氧化酶结构域的自氧化速率快两个数量级。添加底物 L-Arg 和类似抑制剂显着降低了氧化速率，特别是在第一阶段和第二阶段。蝶呤显着增加了第 2 相的比例。另一方面，在蝶呤存在下，氧化速率不随底物或抑制剂而变化，但反应中间体OH-L-Arg显着降低了第一阶段的氧化速率。从这些事实来看，(1) L-Arg 可以稳定氧键合的 NOS。 (2)蝶呤影响氧结合NOS的自氧化速率，但其作用与底物、抑制剂和中间体不同。 (3) 中间体对自氧化速率的影响与底物不同。被建议。