部位特異的変異法によるNO合成酵素の電子移動機構と酸素分子活性化機構の解明

利用定点诱变阐明NO合酶的电子转移机制和氧分子激活机制

基本信息

批准号：
11116201
负责人：
清水透
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

生体内において極めて重要な働きをする伝達物質、一酸化窒素NO、をアルギニンから合成する神経型NO合成酵素(以下NOSと略す)の構造-機能相関、特に電子伝達及び酸素分子活性化の機構について研究した。 (1)NOSはP450型ヘムを含む酸化反応ドメインと還元酵素ドメインとから構成されている。電子は還元酵素ドメインのFNMから酸化反応ドメインのヘムの配位子システインの側(近位側)からヘムへ導入されると推定される。酸化反応ドメインの近位に存在すると推定される良く保存されたLysやArgを他のアミノ酸へ変異させてNO合成活性や電子移動速度などの活性パラメータを調べた。その結果、Lys423の変異体はNO合成活性がなく、NADPHからヘムへの電子移動も野生型に比べて極めて低かった。この結果からLys423はドメイン間電子移動に重要な働きをしている可能性が示唆された。 (2)神経系NOSでは、NO合成活性、及び、還元酵素ドメインから酸化反応ドメインへの電子移動にはカルシウム/カルモデュリンが必須である。又、神経型NOSには誘導型NOSにはない余分な42アミノ酸より成るペプチドがFMNサブドメイン内に存在する。この神経型NOSに存在する余分なペプチドを消失させた変異体を作成し、そのNO合成活性、及び、電子移動速度などの活性パラメータを調べた。その結果、消失変異体では、カルシウム/カルモデュリンを添加しなくても、NO合成活性、及び、NADPHからヘムへの電子移動が観測された。これらの結果より、この余分はペプチドはドメイン間の電子移動を常に阻害しており、カルシウム/カルモデュリンの結合によりこのペプチド周辺の大きな構造変化が誘起されて、ドメイン間の電子移動が可能になると推定された。

神经元NO合酶（以下简称NOS）的结构与功能关系，尤其是电子传递和氧分子活化的机制，在体内起着极其重要的作用。。 (1)NOS由含有P450型血红素的氧化反应结构域和还原酶结构域组成。假设电子从氧化反应域的血红素配体半胱氨酸侧（近侧）从还原酶域的FNM引入到血红素。我们将被认为存在于氧化反应结构域附近的保守的Lys和Arg突变为其他氨基酸，并研究了NO合成活性和电子转移速率等活性参数。结果，Lys423突变体缺乏NO合成活性，与野生型相比，从NADPH到血红素的电子转移极低。这一结果表明Lys423可能在域间电子转移中发挥重要作用。 (2)在神经系统NOS中，钙/钙调蛋白对于NO合成活性和从还原酶结构域到氧化反应结构域的电子转移至关重要。此外，神经元 NOS 在 FMN 子结构域中具有额外的 42 个氨基酸肽，而诱导型 NOS 中不存在该肽。我们创建了一个突变体，其中该神经元 NOS 中存在的额外肽被删除，并研究了其 NO 合成活性和活性参数，例如电子转移率。结果，在缺失突变体中，即使不添加钙/钙调蛋白，也观察到NO合成活性和从NADPH到血红素的电子转移。从这些结果中，我们推断这种额外的肽总是抑制结构域之间的电子转移，并且钙/钙调蛋白的结合诱导了该肽周围的大的结构变化，从而实现了结构域之间的电子转移。