部位特異的変異法によるNO合成酵素の電子移動機構と酸素分子活性化機構の解明

利用定点诱变阐明NO合酶的电子转移机制和氧分子激活机制

基本信息

批准号：
11116201
负责人：
清水透
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

生体内において極めて重要な働きをする伝達物質、一酸化窒素NO、をアルギニンから合成する神経型NO合成酵素(以下NOSと略す)の構造-機能相関、特に電子伝達及び酸素分子活性化の機構について研究した。 (1)NOSはP450型ヘムを含む酸化反応ドメインと還元酵素ドメインとから構成されている。電子は還元酵素ドメインのFNMから酸化反応ドメインのヘムの配位子システインの側(近位側)からヘムへ導入されると推定される。酸化反応ドメインの近位に存在すると推定される良く保存されたLysやArgを他のアミノ酸へ変異させてNO合成活性や電子移動速度などの活性パラメータを調べた。その結果、Lys423の変異体はNO合成活性がなく、NADPHからヘムへの電子移動も野生型に比べて極めて低かった。この結果からLys423はドメイン間電子移動に重要な働きをしている可能性が示唆された。 (2)神経系NOSでは、NO合成活性、及び、還元酵素ドメインから酸化反応ドメインへの電子移動にはカルシウム/カルモデュリンが必須である。又、神経型NOSには誘導型NOSにはない余分な42アミノ酸より成るペプチドがFMNサブドメイン内に存在する。この神経型NOSに存在する余分なペプチドを消失させた変異体を作成し、そのNO合成活性、及び、電子移動速度などの活性パラメータを調べた。その結果、消失変異体では、カルシウム/カルモデュリンを添加しなくても、NO合成活性、及び、NADPHからヘムへの電子移動が観測された。これらの結果より、この余分はペプチドはドメイン間の電子移動を常に阻害しており、カルシウム/カルモデュリンの結合によりこのペプチド周辺の大きな構造変化が誘起されて、ドメイン間の電子移動が可能になると推定された。

我们已经研究了神经NO合酶（以下称为NOS）的结构功能相关性，该酶合成一氧化氧化物NO，这是一种在活体生物体，来自精氨酸，特别是电子转移和氧气转移和氧气分子激活的机制中起着极为重要的作用的发射器。（1）NOS由含有P450血红素和还原酶结构域的氧化反应结构域组成。假定电子从还原酶结构域的FNM引入血红素，从氧化反应域的血红素的配体半胱氨酸的侧面（近端）引入。据推测存在于氧化反应结构域的近端部分中的良好保存的LYS和ARG被突变为其他氨基酸，以检查活性参数，例如NO合成活性和电子转移速率。结果，Lys423突变体没有无合成活性，与野生型相比，电子从NADPH到血红素的转移极低。这些结果表明，lys423可能在域间电子转移中起重要作用。（2）在神经系统NOS中，钙/钙调蛋白对于无合成活性和电子从还原酶结构域转移到氧化反应结构域至关重要。另外，FMN亚域中存在由神经元NOS中未发现的42个额外氨基酸组成的肽。创建了一个突变体，以消除该神经元中存在的过量肽，并检查了其活性参数，例如NO合成活性和电子转移速率。结果，在消失的突变体中，没有添加钙/钙调蛋白，观察到没有合成活性和电子从NADPH到血红素的转移。这些结果表明，这种额外的肽不断抑制域之间的电子转移，而钙/钙调蛋白结合引起了该肽周围的巨大结构变化，从而允许在域之间进行电子转移。