Optimization of Neutron Reflectometry for analysis of biological membrane

生物膜分析中子反射法的优化

基本信息

批准号：
22K12672
负责人：
塩田拓也
金额：
$ 2.58万
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K12672/
关键词：
中性子反射率法インフルエンザ菌膜タンパク質

项目摘要

本研究課題では、膜タンパク質の動的な変化を解析する手法として、界面解析法の一つ中性子反射率法の適応を目指している。中性子反射率法では、Si-Wafer上に生体膜を再構築し、その上部を液体で見たし、固体ー液体界面として解析することで詳細な解析を行う。初年度は、大腸菌のベータバレル型膜タンパク質輸送装置BAM複合体の再構築を目指した。BAM複合体は、中心因子であるBamAにBamB-Eの４つのタンパク質が会合して複合体を形成する。これまで、BamAに対して、BamCを除くサブユニットの会合には成功していたが、BamCのみはBamAに安定的に結合させることができていなかった。今回、BamCが安定して結合できない問題に対して、BamCを生体膜を再構築する際の脂質を加える前にWaferに固定することで、BAM複合体に安定的に取り込まれることがわかった。その後、BAM複合体の他のサブユニットであるBanmA, B, D, Eを加えることでBamCの構造変化を捉えることができた。構造変化がin vivoでも起こりうる生理的な現象であることを部位特異的光架橋法で確認した。また、その中で、構造解析に必要なプロセスである界面活性剤による可溶化が複合体のダイナミクスに大きな影響を与えており、状態が限定されてしまっていた原因であることを突き止めた。そのほか、再構築する膜の標的として、ヘリコバクターピロリ、インフルエンザ菌のタンパク質の精製を行なった。

在本研究项目中，我们的目标是应用中子反射法（一种界面分析方法）作为分析膜蛋白动态变化的方法。在中子反射法中，通过在硅晶片上重建生物膜，将膜的顶部视为液体，并将其作为固液界面进行分析来进行详细分析。第一年，我们的目标是重建大肠杆菌β-桶膜蛋白转运蛋白 BAM 复合物。 BAM 复合物由四种蛋白质 BamB-E 与中心因子 BamA 结合形成。到目前为止，我们已经成功地将BamC以外的亚基与BamA结合，但还不可能单独将BamC与BamA稳定结合。这次，针对BamC无法稳定结合的问题，我们发现通过在添加用于重建生物膜的脂质之前将BamC固定在晶片上，可以将其稳定地掺入BAM复合物中。随后，通过添加 BAM 复合物的其他亚基 BanmA、B、D 和 E，他们能够检测到 BamC 的结构变化。我们通过位点特异性光交联证实结构变化是体内可能发生的生理现象。此外，他们发现表面活性剂的增溶作用是结构分析所必需的过程，对复合物的动力学具有重大影响，也是其有限状态的原因。此外，我们纯化了幽门螺杆菌和流感嗜血杆菌蛋白作为重建的膜靶标。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Discovery of conserved rule and role behind the assembly of bacterial beta-barrel membrane proteins

发现细菌β-桶膜蛋白组装背后的保守规则和作用

DOI：
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
0
作者：
Takuya Shiota;Edward Germany;Nakajohn Thewasano;Kenichiro Imai;Yuki Maruno;Rebecca Bamert;Rhys Dunstan;Yue Ding;Yukari Nakajima;XiangFen Lai;Chaille Webb;Christopher Stubenrauch;Kher Shing Tan;Hsin-Hui Shen;Trevor Lithgow
通讯作者：
Trevor Lithgow

βバレル型膜タンパク質に書き込まれた輸送に必要なシグナルの解明

阐明写入 β-桶膜蛋白的运输所需的信号