in vivo部位特異的光架橋法を用いたミトコンドリア膜透過装置の解析

使用体内位点特异性光交联方法分析线粒体膜渗透装置

• 批准号: 09J08047
• 负责人: 塩田 拓也
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J08047/
• 关键词: ミトコンドリア; 部位特異的光架橋法; シャペロン; 質量分析; 分子シャペロン

私は、in vivo部位特異的光架橋法を用いて、ミトコンドリア外膜膜透過装置のTOM40複合体のサブユニットで、受容体など多様な機能をもつ、Tom22の相互作用解析を行っている。in vivo部位特異的光架橋法とは、解析対象のタンパク質にBPAという光架橋側鎖をもつ非天然アミノ酸を部位特異的に導入し、UV照射により架橋を行う方法で、アミノ酸残基レベルの空間分解能で相互作用解析が行える手法である。Tom22について,サイトゾルドメインとTOM40複合体のもうひとつの受容体サブユニットTom20との相互作用,膜間部ドメインと内膜膜透過装置TIM23複合体の受容体サブユニットTim50との相互作用について,基質プレ配列または基質前駆体の存在下と非存在下,in vivoおよびin organelloで部位特異的光架橋を用いて解析し,Tom22の機能時の動的なタンパク質間相互作用変化を解明した。得られた結果は,in vivo部位特異的光架橋法が細胞内における膜タンパク質複合体の機能と関連した相互作用及びその変化を十分な空間分解能で明らかにできる強力な手法であることを示すものであり,PANS誌に論文発表した。さらに酵母細胞内で過剰発現したTom22がTOM40複合体に組み込まれる前に一過的に相互作用する因子として,サイトゾルのシャペロンに加えてミトコンドリア外膜タンパク質ポリン(Por1)を見出した。野生株、Por1破壊株、Por2破壊株におけるTom22の安定性をシクロヘキシミドチェイス実験により検討した。その結果、Por1破壊株ではTom22の安定性にわずかに影響が見られた。以上の結果から、Por1はTOM40複合体に含まれなかったTom22と一時的に相互作用し、分解から保護していることが示唆された

我正在使用体内位点特异性光交联方法来分析 Tom22 的相互作用，Tom22 是线粒体外膜透化装置 TOM40 复合物的一个亚基，具有包括受体在内的多种功能。体内位点特异性光交联是将具有可光交联侧链的非天然氨基酸BPA位点特异性地引入到待分析的蛋白质中，并通过紫外线照射进行交联的方法，这是一种允许相互作用的方法。以高分辨率进行分析。关于Tom22，胞质结构域与TOM40复合物的另一个受体亚基Tom20之间的相互作用，以及内膜透化剂TIM23复合物的膜间结构域与受体亚基Tim50之间的相互作用，底物利用体内位点特异性光交联和在存在和不存在前序列或底物前体的细胞器中，我们阐明了 Tom22 功能期间动态蛋白质-蛋白质相互作用的变化。获得的结果表明，体内位点特异性光交联是一种强大的方法，可以以足够的空间分辨率揭示细胞内膜蛋白复合物功能的相互作用和变化。除了胞质伴侣之外，我们还发现线粒体外膜蛋白孔蛋白 (Por1) 作为一种因子，在掺入 TOM40 复合物之前与酵母细胞中过表达的 Tom22 短暂相互作用。通过放线菌酮追踪实验研究了Tom22在野生型菌株、Por1破坏菌株和Por2破坏菌株中的稳定性。结果，Tom22 的稳定性在 Por1 破坏的菌株中受到轻微影响。这些结果表明，Por1 暂时与 Tom22（不包含在 TOM40 复合物中）相互作用，并保护其免遭降解。

项目成果

in vivo部位特異的光架橋法を用いた、ミトコンドリア外膜タンパク質Tom22の外膜挿入機構の解析

利用体内定点光交联方法分析线粒体外膜蛋白Tom22的外膜插入机制

• 发表时间: 2011
• 作者: Norihiko Kawai;Tomokazu Sato;Naokazu Yokoya;塩田拓也
• 通讯作者: 塩田拓也

in vivo部位特異的光架橋法によるミトコンドリア膜透過装置の解析

使用体内位点特异性光交联方法分析线粒体膜渗透装置

• 发表时间: 2011
• 作者: Katsuhiko Matsumoto;Yuta Shinohara;Kyoko Numajiri;Shinya Ishioroshi;Takashi Morii;Yoshio Saito;Isao Saito;塩田拓也
• 通讯作者: 塩田拓也

Analysis of the interaction mapping of Tom22, a component of the mit-ochondrial outer membrane translocator, by using in vivo site-specific photoctrosslinking

通过使用体内位点特异性光交联分析 Tom22（线粒体外膜易位蛋白的一个组成部分）的相互作用作图

• 发表时间: 2010
• 作者: Norihiko Kawai;Tomokazu Sato;Naokazu Yokoya;塩田拓也;齋藤義雄・高橋尚弥・松本桂彦・篠原雄太・竹内辰樹・齋藤烈;塩田拓也;松本桂彦・篠原雄太・竹内辰樹・齋藤義雄・齋藤烈・森井孝;塩田拓也;塩田拓也
• 通讯作者: 塩田拓也

in vivo部位特異的光架橋法を用いたミトコンドリア外膜膜透過装置サブユニットTom22の解析

使用体内位点特异性光交联方法分析线粒体外膜膜透化亚基 Tom22

• 发表时间: 2010
• 作者: Norihiko Kawai;Tomokazu Sato;Naokazu Yokoya;塩田拓也;齋藤義雄・高橋尚弥・松本桂彦・篠原雄太・竹内辰樹・齋藤烈;塩田拓也
• 通讯作者: 塩田拓也

Analysis of the protein interaction mapping of Tom22, a component of the mitochondrial outer membrane translocator, by using in vivo site-specific photocrosslinking

使用体内位点特异性光交联分析 Tom22（线粒体外膜易位蛋白的一个组成部分）的蛋白质相互作用图谱

• 发表时间: 2011
• 作者: Takuya Shiota;Hide Mabuchi;Sachiko Tanaka-Yamano;Koji Yamano;and Toshiya Endo
• 通讯作者: and Toshiya Endo