Analysis of the assembly of the beta-barrel membrane proteins into the E. coli outer membrane by the EMM assembly assay

通过 EMM 组装测定分析 β-桶膜蛋白组装到大肠杆菌外膜中的情况

基本信息

批准号：
18H06052
负责人：
塩田拓也
金额：
$ 1.91万
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-08-24 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

大腸菌等のグラム陰性菌外膜にはβバレル型膜タンパク質が存在し、これらは生育、感染および、毒物の排出等、重要な役割を担う。βバレル型膜タンパク質の外膜への正しい立体構造を伴った組込みは、BAM複合体と呼ばれるタンパク質複合体によって行われる。BAM複合体はBamA, B, C, D, Eの5つのタンパク質から構成されており、近年その立体構造が解かれたが、各サブユニットの役割等は不明なままである。本研究では、研究者が独自に開発したin vitro再構築実験系、EMMアセンブリーアッセイを用いて、各サブユニットの役割の決定を通して、BAM複合体の分子機構の解明を目指す。これまでに、EMMアセンブリーアッセイによる解析から、BamCはBAM複合体から基質タンパク質を送り出す役割を担っていることを明らかにした。報告されているBAM複合体の立体構造では、BamCはその一部が観察されているのみで、大部分の構造は観察されていなかった。そこで、in vivo部位特異的光架橋法により生細胞内でのBamC分子全体の相互作用マップを作製し、BamCのC末端ドメインがBamAの細胞表層に露出している部分と相互作用していることを明らかにした。この配置は、ミトコンドリアに存在するBAM複合体のホモログSAM複合体に存在するSam37と同様であった。Sam37は、BamCと同様に基質の送り出しに関わるため、両者は同様の分子機構を有していると考えられる。その他、EMMアセンブリーアッセイを用いて、BAM複合体の機能を阻害するペプチド断片を数種決定した。現在、その他のサブユニットの機能解析を進めると共に、阻害ペプチドの作用機構を解析し、機能に重要な領域を決定することを試みている。

β-桶膜蛋白存在于大肠杆菌等革兰氏阴性菌的外膜中，在生长、感染和毒素排泄中发挥重要作用。 β-桶膜蛋白正确构象整合到外膜中是由称为 BAM 复合物的蛋白质复合物进行的。 BAM复合体由BamA、B、C、D和E五种蛋白质组成，虽然近年来其三维结构已被解开，但各亚基的作用仍不清楚。在本研究中，我们旨在通过使用研究人员开发的体外重建实验系统（EMM 组装测定）确定每个亚基的作用来阐明 BAM 复合物的分子机制。到目前为止，使用 EMM 组装分析的分析表明，BamC 在从 BAM 复合物中输出底物蛋白方面发挥着作用。在报道的BAM复合物的三维结构中，仅观察到了BamC的一部分，大部分结构尚未观察到。因此，我们使用体内位点特异性光交联方法创建了活细胞中整个 BamC 分子的相互作用图，并证实了 BamC 的 C 末端结构域与暴露在细胞表面的 BamA 部分相互作用。这种排列与 Sam37 相似，Sam37 存在于 SAM 复合体中，而 SAM 复合体是线粒体中存在的 BAM 复合体的同源物。 Sam37与BamC一样，参与底物输出，因此认为两者具有相似的分子机制。此外，使用 EMM 组装测定确定了抑制 BAM 复合物功能的几种肽片段。目前，我们正在进行其他亚基的功能分析，分析抑制肽的作用机制，并试图确定对其功能重要的区域。

项目成果

期刊论文数量（5）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Cell cycle-dependent dynamic association of the mitochondrial protein entry gate, TOM complex

线粒体蛋白进入门 TOM 复合物的细胞周期依赖性动态关联

DOI：
发表时间：
2018
期刊：
影响因子：
0
作者：
俊山礼志;今野雅允;野田剛広;浅井歩;小関準;川本弘一;坂井大介;工藤敏啓 ;佐藤太郎;江口英利;土岐祐一郎;森正樹;石井秀始;塩田拓也
通讯作者：
塩田拓也

Porin Associates with Tom22 to Regulate the Mitochondrial Protein Gate Assembly

DOI：
10.1016/j.molcel.2019.01.003
发表时间：
2019-03-07
期刊：
MOLECULAR CELL
影响因子：
16
作者：
Sakaue, Haruka;Shiota, Takuya;Endo, Toshiya
通讯作者：
Endo, Toshiya

Analysis of the molecular mechanism of E. coli BAM complex by new method "EMM assembly assay"

新方法“EMM组装分析”分析大肠杆菌BAM复合物分子机制

DOI：
发表时间：
2019
期刊：
影响因子：
0
作者：
Sakaue Haruka;Shiota Takuya;Ishizaka Naoya;Kawano Shin;Tamura Yasushi;Tan Kher Shing;Imai Kenichiro;Motono Chie;Hirokawa Takatsugu;Taki Kentaro;Miyata Non;Kuge Osamu;Lithgow Trevor;Endo Toshiya;鈴木雅登;塩田　拓也;井ノ崎玲於奈，窪田慎太郎，鈴木雅登，安川智之;塩田　拓也
通讯作者：
塩田　拓也

EMM アセンブリーアッセイを用いた外膜タンパク質アセンブリーの分子メカニズム解析

EMM组装分析外膜蛋白组装的分子机制

DOI：
发表时间：
2019
期刊：
影响因子：
0
作者：
Sakaue Haruka;Shiota Takuya;Ishizaka Naoya;Kawano Shin;Tamura Yasushi;Tan Kher Shing;Imai Kenichiro;Motono Chie;Hirokawa Takatsugu;Taki Kentaro;Miyata Non;Kuge Osamu;Lithgow Trevor;Endo Toshiya;鈴木雅登;塩田　拓也
通讯作者：
塩田　拓也

Monash University/Biomedicine Discovery Institute/Department of Microbiology(オーストラリア)

莫纳什大学/生物医学发现研究所/微生物学系（澳大利亚）