植物病原菌代謝産物の植物成長促進活性の解明

阐明植物病原体代谢物的植物生长促进活性

• 批准号: 22K19106
• 负责人: 大神田 淳子
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Shinshu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19106/
• 关键词: フシコクシン; 14-3-3; bump and hole; 合理設計; 成長促進活性; プロトンATPase; 気孔開口

最近我々は、ジテルペン配糖体フシコクシン (FC)が孔辺細胞中の細胞膜 (PM) H+-ATPaseと14-3-3の安定な3者会合体を形成することで気孔開口と光合成活性を亢進し、成長を促進させる活性を持つことを見出した。PM H+-ATPaseと14-3-3は植物全体に発現し、養分吸収、輸送などにも関与するため、FCが気孔開口を介して成長促進効果にどの程度関与しているかはまだ明らかではない。本研究では、FCによる気孔開口と成長促進効果の相関を詳細に検証する目的で、FCと14-3-3のbump-and-holeペアを開発した。設計として、14-3-3のF129を小さい疎水性アミノ酸残基に点変異させ、FCの16位に空間を充填するような置換基を導入することを考えた。FC-Hの16位に種々の置換基を導入した誘導体を合成した。また、野生型およびF129G, A, V変異を導入した組換え14-3-3を大腸菌から発現精製した。さらに、AHA2 C末端に蛍光基を導入したリン酸化C末端ペプチドを用いた蛍光偏光滴定実験により乖離定数を算出し、化合物の安定化効果を評価することで最適な直交性ペアの探索を行った。16位にOBn基を導入したFC誘導体がWTとAHA2ペプチドの相互作用に対して作用しない一方で、F129G変異体との結合をわずかに安定化し、直交性ペアとして機能することがわかった。水素結合ドナーとして3位に水酸基を導入した16位OBn体はF129Gにのみ約20倍の安定化効果を示した。In vitro結合試験で直交性ペアの探索を行ったところ、16位にOBn基を導入したFC誘導体が野生型とAHA2ペプチドの相互作用に対して作用しない一方で、F129G変異体との結合を有意に安定化し、直交性ペアとして機能することが分かった。本ペアは、FCによる気孔開口と成長促進機構解明に役立つと期待される。

最近，我们发现二萜糖苷fusicoccin（FC）通过与保卫细胞中的质膜（PM）H+-ATP酶形成稳定的14-3-3三元缔合来增强气孔开放和光合活性，并发现其具有生长作用。 - 促进活动。 PM H+-ATPase和14-3-3在整个植物中表达，也参与养分吸收、运输等，因此目前还不清楚FC在多大程度上参与通过气孔开放的促生长作用。在本研究中，我们开发了 FC 和 14-3-3 的凹凸孔对，以详细研究气孔开放与 FC 的生长促进作用之间的相关性。作为设计，我们考虑将 14-3-3 的 F129 点突变为小的疏水性氨基酸残基，并在 FC 的 16 位引入空间填充取代基。我们合成了在第16位引入各种取代基的FC-H衍生物。此外，从大肠杆菌中表达并纯化了野生型和引入了F129G、A和V突变的重组14-3-3。此外，我们使用AHA2 C末端引入荧光基团的磷酸化C末端肽，通过荧光偏振滴定实验计算了解离常数，并通过评估化合物的稳定效果来寻找最佳正交对。结果发现，虽然在第 16 位引入 OBn 基团的 FC 衍生物对 WT 和 AHA2 肽之间的相互作用没有影响，但它稍微稳定了与 F129G 突变体的结合，并起到正交对的作用。 16位的OBn形式，其中在3位引入羟基作为氢键供体，仅对F129G显示出约20倍的稳定效果。当我们在体外结合测试中寻找正交对时，我们发现虽然在第16位引入OBn基团的FC衍生物对野生型和AHA2肽之间的相互作用没有影响，但它显着抑制与F129G突变体的结合发现它们是稳定的并且作为正交对发挥作用。这对有望有助于阐明 FC 的气孔开放和生长促进机制。

项目成果

ジテルペン配糖体フシコクシンと 14-3-3たんぱく質の直交性ペアの開発

二萜糖苷梭菌素和 14-3-3 蛋白正交对的开发

• 发表时间: 2023
• 作者: 桐山 寛生;大神田 淳子
• 通讯作者: 大神田 淳子