植物病原菌代謝産物の植物成長促進活性の解明

阐明植物病原体代谢物的植物生长促进活性

• 批准号: 22K19106
• 负责人: 大神田 淳子
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Shinshu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19106/
• 关键词: フシコクシン; 14-3-3; bump and hole; 合理設計; 成長促進活性; プロトンATPase; 気孔開口

最近我々は、ジテルペン配糖体フシコクシン (FC)が孔辺細胞中の細胞膜 (PM) H+-ATPaseと14-3-3の安定な3者会合体を形成することで気孔開口と光合成活性を亢進し、成長を促進させる活性を持つことを見出した。PM H+-ATPaseと14-3-3は植物全体に発現し、養分吸収、輸送などにも関与するため、FCが気孔開口を介して成長促進効果にどの程度関与しているかはまだ明らかではない。本研究では、FCによる気孔開口と成長促進効果の相関を詳細に検証する目的で、FCと14-3-3のbump-and-holeペアを開発した。設計として、14-3-3のF129を小さい疎水性アミノ酸残基に点変異させ、FCの16位に空間を充填するような置換基を導入することを考えた。FC-Hの16位に種々の置換基を導入した誘導体を合成した。また、野生型およびF129G, A, V変異を導入した組換え14-3-3を大腸菌から発現精製した。さらに、AHA2 C末端に蛍光基を導入したリン酸化C末端ペプチドを用いた蛍光偏光滴定実験により乖離定数を算出し、化合物の安定化効果を評価することで最適な直交性ペアの探索を行った。16位にOBn基を導入したFC誘導体がWTとAHA2ペプチドの相互作用に対して作用しない一方で、F129G変異体との結合をわずかに安定化し、直交性ペアとして機能することがわかった。水素結合ドナーとして3位に水酸基を導入した16位OBn体はF129Gにのみ約20倍の安定化効果を示した。In vitro結合試験で直交性ペアの探索を行ったところ、16位にOBn基を導入したFC誘導体が野生型とAHA2ペプチドの相互作用に対して作用しない一方で、F129G変異体との結合を有意に安定化し、直交性ペアとして機能することが分かった。本ペアは、FCによる気孔開口と成長促進機構解明に役立つと期待される。

最近，我们发现二萜糖苷fcicocin（FC）具有通过形成稳定的细胞膜（PM）H+-ATPase和14-3-3的稳定的三角分明缔合来促进气孔开放和光合作用活性。由于PM H+-ATPase和14-3-3在整个植物中都表达并参与营养吸收和运输，因此尚不清楚FC在多大程度上通过气孔开口涉及生长促进作用。在这项研究中，我们开发了一对FC和14-3-3，目的是验证FC引起的气孔开放与促进生长效应之间的相关性。作为一种设计，我们将14-3-3处F129的点突变视为一个小的疏水氨基酸残基，并引入了填充FC位置16位置的取代基。合成了在FC-H的第16位中引入各种取代基的衍生物。此外，从大肠杆菌中表达并纯化了引入野生型和F129G（A和V突变）的重组14-3-3。此外，通过使用磷酸化的C末端肽进行荧光极化滴定实验计算偏差常数，该磷酸化的C末端肽在C末端AHA2处引入了荧光组，并通过评估该化合物的稳定作用，即搜索最佳正交对。发现在16位置引入OBN组的FC衍生物不作用于WT和AHA2肽的相互作用，而稍微稳定在与F129G突变体的结合并用作正交对。第16位OBN在第三位以氢键供体的位置引入了羟基，其稳定作用仅在F129G上约20倍。当在体外结合测试中搜索正交对时，发现FC衍生物在位置16处引入OBN组的FC衍生物没有作用于野生型与AHA2肽之间的相互作用，而显着稳定在与F129G突变体中的结合显着稳定，并充当正能量。预计这对有助于阐明FC的气孔开放和增长促进机制。

项目成果

ジテルペン配糖体フシコクシンと 14-3-3たんぱく質の直交性ペアの開発

二萜糖苷梭菌素和 14-3-3 蛋白正交对的开发

• 发表时间: 2023
• 作者: 桐山 寛生;大神田 淳子
• 通讯作者: 大神田 淳子