δ型ホスホリパーゼCの構造と細胞内ターゲッティング

δ型磷脂酶C的结构和细胞内靶向

基本信息

批准号：
08680699
负责人：
八木澤仁
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年までにPLC-δ1遺伝子ならびにその変異体の大腸菌発現系、酵母発現系および動物細胞発現系を確立する作業を行った。本年度はこれらの系を利用してin vitro, in vivoでの酵素活性と分子間相互作用の検討、また本酵素の構造と機能(特に細胞内機能)との関係についての詳細な検討を行った。(1) PLC-δ1の構造解析:(1)高純度のレコンビナントPLC-δ1を調整し、構造解析のための結晶化を試みた。幾つかの条件で微結晶が得られるようになったが、現在までにX線解析に興せられるような結晶は得られていない。(2)酵素活性がCa^<2+>依存性を持つことにより、本酵素のCa^<2+>結合部位を種々の欠失変異体を用いて解析した。その結果、本酵素には5〜6個のCa^<2+>結合部位があり、そのうち1〜2個はC端のC2領域に存在すること、またこの領域中の一部のアミノ酸置換により酵素活性が著明に低下することが判明した。我々がこれまでに解析したPH領域以外にも触媒活性の機能修飾部位が存在することが明らかになった。(3)他のいくつかのPH領域含有タンパクに対するモジュレーターとして知られるGタンパクβγサブユニットはin vitro, in vivoいずれの条件でもPLC-δ1と相互作用していることが明らかになった。(4)本酵素がセリン・スレオニン型キナーゼ、特にタンパクキナーゼCの基質になりうることがin vitroでのリン酸化実験により判明した。またin vivoリン酸化を行い、リン酸化がスレオニンにおこることを明らかにした。現在、リン酸化部位の特定と、細胞応答に伴うリン酸化の変動の有無を調べている。(2)無傷細胞におけるPLC-δ1の機能解析:培養細胞(MDCK, PC12)を使用し、PLC-δ1の局在性の変化を観察した。(1) MDCKにマイクロインジェクションによりPH領域変異体を導入し、免疫組織化学的に酵素の局在を調べることによって、PH領域の膜移行にN端37-43残基に含まれる4個の塩基性アミノ酸のそれぞれが決定的に重要であることを明らかにした。(2)内在性PLC-δ1をもつPC12に対し、IP3/PIP2結合領域(30-43)に相当する合成ペプチドを電気穿孔法により細胞内導入を行ったところ、この領域が細胞の形態維持に必要であることを示唆する結果を得た。

直到去年，这项工作才开始为PLC-Δ1基因及其突变体建立大肠杆菌，酵母和动物细胞表达系统。今年，我们使用这些系统在体外和体内研究了酶活性和分子间相互作用，并详细研究了该酶（尤其是细胞内功能）之间的结构和功能之间的关系。（1）PLC-Δ1的结构分析：（1）调整高纯度重组PLC-Δ1并结晶以进行结构分析。现在已经在几个条件下获得了微晶，但是迄今为止，无法获得可以通过X射线分析获得的晶体。（2）由于酶活性是Ca^<2+>依赖性的，因此使用各种缺失突变体分析了该酶的Ca^<2+>结合位点。结果，发现该酶具有5至6个Ca^<2+>结合位点，其中C2末端的C2区域中存在一到两个，并且该区域的该部分显着降低了酶活性。据透露，除了pH区域以外，我们已经分析了催化功能修饰位点。（3）据透露，在体外和体内条件下，G蛋白的βγ亚基与其他几种含有pH区域的蛋白的调节剂相互作用。（4）体外磷酸化实验表明，该酶可以是丝氨酸 - 硫代激酶，尤其是蛋白激酶C的底物。还进行了体内磷酸化，并且发现磷酸化发生在苏氨酸中。目前，我们正在研究磷酸化位点的鉴定，以及是否与细胞反应相关的磷酸化发生了变化。（2）使用培养细胞（MDCK，PC12）观察到完整细胞中PLC-Δ1的功能分析：PLC-Δ1的定位变化。（1）通过将pH区突变体通过显微注射引入MDCK并从N-terminus残基37-43中包含的四个基本氨基酸中的每一种中的每一种都至关重要，从而引入了MDCK pH区突变体并检查酶定位。（2）当将与IP3/PIP2结合区域相对应的合成肽（30-43）通过电穿孔引入带有内源性PLC-Δ1的PC12时，结果表明该区域对于维持细胞形态是必不可少的。