2-ハロ酸デハロゲナーゼ反応の立体特異性を規定するタンパク質構造と触媒機構

决定2-卤酸脱卤酶反应立体特异性的蛋白质结构和催化机制

基本信息

批准号：
08680682
负责人：
江崎信芳
金额：
--
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

L-2-ハロ酸デハロゲナーゼは、L-2-ハロ酸の加水分解的脱ハロゲン反応を触媒する酵素で、L-ハロ酸のみを基質とし立体反転を伴ってD-ヒドロキシ酸を生成する酵素(L-DEX)や、D,L-両ハロ酸に作用するもの(DL-DEX)などが見出されている。本研究では、酵素タンパク質の分子進化の解明に資することを目的に、Pseudomonas sp.YLのL-DEXとPs.putida AJ-1のDL-DEXの構造と機能の解析を行った。L-DEXとヒドロキシルアミンを基質存在下で反応させた場合、酵素の失活が認められた。失活酵素のイオンスプレー質量分析装置などによる解析から、Asp10が修飾されてアスパラギン酸β-ヒドロキシム酸カルボキシアルキルエステルが生成している可能性が示された。この結果は、水よりも求核性が高いヒドロキシルアミンが、水分子の代わりにエステル中間体を攻撃し、Asp10が修飾されて酵素が失活することを示唆し、L-DEXの反応では、Asp10が求核性触媒基をして基質a-炭素に作用し、エステル中間体が形成されることが予想された。またAsp10近傍のAsp180の変異酵素であるD180Nと基質を反応させ、質量分析を行ったところ、変異酵素では基質に相当する分子量の増加が見られた。タンデムMS-MS解析により、この増加はAsp10の修飾に伴うことも確認され、Asp180はエステル中間体の加水分解反応に関与することが判明した。一方、本研究ではDL-DEXをコードする遺伝子の全一次配列を明らかにするとともに、DL-DEXと一次構造上の相同性を示すD-2-ハロ酸デハロゲナーゼとの間で保存されている26残基の極性アミノ酸の部位特異的変異を行い、DL-DEXのThr65、Glu69、Asp194が、D-,L-どちらの基質との反応についても必須であることを明かにした。

L-2-甲酸酸脱核酶是一种酶，可催化L-2-HaloAcid的水解去催化性，以及使用L-甲酸酸作为底物的酶，并与空间反转产生D-羟基酸，并在DL-HaloAcids（DL-DEX）（DL-DEX）（DL-DEX）（DL-DEX）（DL-DEX）（DL-DEX）作用。在这项研究中，我们分析了L-DEX在pseudomonas sp.yl和dl-dex中的结构和功能，目的是有助于酶蛋白的分子进化。当L-DEX和羟胺在存在底物的情况下反应时，观察到酶失活。使用离子喷雾质谱仪等分析灭活酶的分析表明，ASP10可以修饰以形成天冬氨酸β-羟基乙酸羧基酯。 This result suggests that hydroxylamine, which is more nucleophilic than water, attacks the ester intermediate in place of the water molecule, and asp10 is modified to deactivate the enzyme, and in the reaction of L-DEX, Asp10 acts as a nucleophilic catalytic group to act on the substrate a-carbon, forming the ester intermediate.此外，当底物与D180N反应时，ASP10附近的ASP180突变酶并进行了质量分析时，在突变酶中增加了与底物相对应的分子量。串联MS-MS分析还证实，这种增加伴随着ASP10的修饰，ASP180参与了酯中间体的水解反应。另一方面，这项研究揭示了编码DL-DEX的基因的完整序列，以及在DL-DEX和D-2-HaloAcid脱氢酶之间保守的26个残基的位定向氨基酸突变，这些突变表现出主要的结构同源性，表现出THR65，GLU69，GLU69，以及与DL-DL-DL-DL-DEX的必不可少的Reciest and DL-DL-DISTR-DL-DL-DISTR。