古細菌の蛋白質膜透過機構の解明と高度好塩古細菌を宿主とした膜蛋白質高生産系の構築

阐明古细菌的蛋白膜渗透机制并构建以高嗜盐古细菌为宿主的高产膜蛋白系统

基本信息

批准号：
12876021
负责人：
江崎信芳
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

真正細菌、真核生物とともに生物界を構成する三つのドメインの一つ古細菌の蛋白質膜透過装置を明らかにすることを目的として、高度好塩古細菌Haloferax volcaniiの膜透過装置を研究した。また、高度好塩古細菌を宿主とした膜蛋白質高生産系の開発を目的として、本菌の膜透過装置の増強を試みた。1.高度に精製したポリエチレングリコールを用いたH.volcaniiの形質転換法を確立した。2.H.volcaniiのゲノムライブラリーから単離した膜透過装置の構成因子(SecY、SecE)の遺伝子をH.volcanii用ベクターpMDS15のP2プロモーター下流に挿入し、制限酵素処理により、プロモーター下流にSecYあるいはSecE遺伝子が挿入されたDNA断片を得た。各断片を発現用シャトルベクターpMLH3およびpMDS30に各々挿入しSecEの発現用ベクターp30EとSecY発現用ベクターp3Yを構築した。またSecYとEの共発現用ベクターとしてp3YにSecE DNA断片を挿入したp3YEを構築した。これらにより、H.volcaniiの膜透過装置を増強できれば、膜蛋白質の生産量増加が期待される。3.膜透過装置を構成する新規因子を探索するため、架橋剤を用いてSecY近傍に存在する蛋白質の同定を試みた。架橋剤(EGS、Sulfo-EGS、DST)および架橋反応液中の塩濃度を変えることにより条件検討を行った。その結果、SecYに対する抗体を用いたウェスタンブロット解析によりSecYと架橋されるタンパク質の存在が明らかとなった。架橋されたタシパク質の同定により、SecYやSecE以外の膜透過装置構成因子を明らかにできるものと考えられる。

我们研究了高度卤素古细菌卤素火山的膜通透剂，目的是阐明古细菌的蛋白质膜通透剂，这是构成生物王国与精美细菌和真核生物的三个结构域之一。此外，我们试图增强该细菌的膜通透性装置，目的是使用高卤代古细菌作为宿主开发高生产的膜蛋白生产系统。 1。已经建立了一种使用高纯化的聚乙烯甘氨酸转化火山林的方法。 2. The gene for the constituent factor (SecY, SecE) of the membrane permeabilizer isolated from the H. volcanii genomic library was inserted downstream of the P2 promoter of the H. volcanii vector pMDS15, and by restriction enzyme treatment, a DNA fragment containing the SecY or SecE genes inserted downstream of the promoter was obtained.将每个片段插入表达班车载体PMLH3和PMD030中，并构建了Sece和Secy的表达矢量P30E。此外，构建了P3YE，其中将SECE DNA片段插入P3Y中，作为Secy和E的载体进行表达，如果可以增强H.火山菌的膜通透性设备，则可以预计，膜蛋白的产生将增加。 3。为了寻找构成膜通透性剂的新因素，我们试图使用交联剂鉴定Secy附近存在的蛋白质。通过在交联反应溶液中改变交联剂（例如，硫-EG，DST）和盐浓度来检查条件。结果，使用针对Secy的抗体的蛋白质印迹分析揭示了与Secy交联的蛋白质的存在。据信，鉴定交联的tasiparc可以揭示Secy和Sece以外的其他膜渗透器。