アンチセンスDNAの至適投与法の確立を目指した体内動態、細胞内動態解析法の開発

开发生物动力学和细胞内动力学分析方法，旨在建立反义 DNA 的最佳施用方法

基本信息

批准号：
09877455
负责人：
杉山雄一
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度に引き続き、アンチセンスの体内動態ならびに薬効の評価系確立を目的とした検討を行った。デリバリーする際の有効な標的部位となるレセプター介在性エンドサイトーシスに関する速度論解析を行い、問題点の一つであるダウンレギュレーションのin vivo評価系の確立を試みた。肝細胞増殖因子受容体として知られるc-metのダウンレギュレーションを過剰量リガンドで引き起こしたところ臓器非特異的にc-metの低下と回復が観察された。臓器細胞膜分画を調製しWestern blot法により細胞表面レセプターの定量化を行ったところ、得られた発現量とリガンドの臓器クリアランスとの間に比例関係があり、本手法によりin vivoレベルでのダウンレギュレーションの解析が可能であることが示唆された。これまで我々が試みてきたエンドサイトーシス速度論モデル構築において、本手法を用いることによりレセプター側の動きについても情報を得ることが可能となった。そこでアンチセンスの薬効評価系として申請者らが精通している薬物輸送蛋白質(トランスポーター)の機能発現をターゲットとした。すなわち肝細胞血管側に発現するトランスポーターに対するアンチセンスを構築し、蛋白の発現量と機能について検討を行った。アフリカツメガエル卵母細胞発現系で肝臓総mRNAに対するハイブリダイゼーションを行いアンチセンスの本質的活性を確認した。また肝トランスポーターの基質を数種類選択し、これらの肝細胞取り込みに占めるトランスポーターNtcpならびにoatp-1の寄与率を算出した。これによりin vivoでアンチセンスをターゲティングした際の、機能(肝細胞への基質の取り込み)の最大活性を見積ることが可能となり、薬効発現系の確立につながるものとなった。

继去年之后，我们开展了旨在建立反义药的药代动力学和药效评价体系的研究。我们对受体介导的内吞作用（这是有效的递送靶位点）进行了动力学分析，并尝试建立下调的体内评估系统，这是问题之一。当我们用过量的配体诱导 c-met（称为肝细胞生长因子受体）下调时，我们观察到 c-met 以非器官特异性方式减少和恢复。当我们制备器官细胞膜组分并使用Western blot方法定量细胞表面受体时，我们发现获得的表达水平与配体的器官清除之间存在比例关系，并且该方法可用于减少配体的量体内水平的受体被认为是可能的。在我们迄今为止一直尝试构建的内吞动力学模型中，通过使用这种方法，可以获得有关受体侧运动的信息。因此，我们针对申请人所熟悉的药物转运蛋白（转运蛋白）的功能表达，作为反义药物疗效评估系统。具体而言，我们构建了针对肝细胞血管侧表达的转运蛋白的反义蛋白，并检查了该蛋白的表达水平和功能。通过与爪蟾卵母细胞表达系统中的肝脏总 mRNA 杂交，证实了反义的基本活性。我们还选择了几种类型的肝脏转运蛋白底物，并计算了转运蛋白 Ntcp 和 oatp-1 对肝细胞摄取的贡献。这使得在体内靶向反义时估计最大功能活性（肝细胞的底物摄取）成为可能，从而建立了表达药物功效的系统。