RNA干渉法を用いたトランスポーターノックダウンマウスの作出と薬物動態解析

利用RNA干扰法和药代动力学分析产生转运蛋白敲低小鼠

基本信息

批准号：
03F03305
负责人：
杉山雄一
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F03305/
关键词：
トランスポーター RNAi ERMタンパク ERM蛋白

项目摘要

肝臓の血管側膜および胆管側膜には、薬物の体内動態決定要素として重要なトランスポーターが複数発現している。一般的に、トランスポーターの基質の選択性は重複する場合が多いこと、さらにそれぞれの基質によりこの重複も変化することが知られている。従って基質選択性に関するそれぞれのトランスポーターの寄与を解析するためには、現状としてそれぞれの特異的な阻害剤を用いたり、ノックアウトマウスを作成し解析を行っている。しかし特異的な阻害剤が見つからない場合も多いこと、またノックアウトマウスの作成には時間がかかることなどの理由からその解析は困難なことが多い。本課題では、RNA干渉法で特異的にトランスポーターの発現を抑制したノックダウンマウスの作出を目標とし、さらにそれを用いた寄与率の検討を考えている。そこで胆管側膜のトランスポーターに着目し、ERMタンパクをモデル標的タンパクとした検討を行っている。ERM蛋白のひとつであるRadixinをノックアウトしたマウスは胆汁うっ滞を起こすが、これは肝臓の胆管側膜に発現するMRP2が内在化に起因することが近年報告された。つまり、ノックダウンマウスの機能解析は胆汁うっ滞を起こしているか否かで比較的容易に検討することができると思われる。前年度に引き続き、ノックダウン細胞の構築を行ったところ、Radixin, Ezrinそれぞれの発現が半分以上抑制されているが、ホスト細胞の性質はあまり損なわれていない安定発現株を樹立することができた。また、この細胞には内在的にMRP2およびEzrin、Radixinの発現が確認されているが、MRP2抗体を用いた免疫沈降の結果よりそれらが結合していることが示された。さらにコントロール細胞と比較して、細胞膜に局在するMRP2量の減少が観察された。今後はこのsiRNAを発現するマウスを作成し、その特性をノックアウトマウスと比較したいと考えている。

多种转运蛋白是药物药代动力学的重要决定因素，在肝脏的血管和胆管膜中表达。一般来说，已知转运蛋白的底物选择性经常重叠，并且这种重叠根据每种底物而变化。因此，为了分析每种转运蛋白对底物选择性的贡献，我们目前对每种转运蛋白使用特定的抑制剂或创建基因敲除小鼠进行分析。然而，分析通常很困难，因为通常找不到特定的抑制剂，并且创建基因敲除小鼠需要时间。在这个项目中，我们的目标是创建利用RNA干扰特异性抑制转运蛋白表达的敲除小鼠，并且我们也在考虑使用这种方法来检查贡献率。因此，我们将重点放在胆管膜上的转运蛋白上，并使用 ERM 蛋白作为模型靶蛋白。 Radixin（一种ERM蛋白）被敲除的小鼠会出现胆汁淤积，最近有报道称，这是由MRP2内化引起的，MRP2在肝脏胆管的侧膜中表达。换句话说，似乎可以根据是否发生胆汁淤积相对容易地对敲除小鼠进行功能分析。继去年之后，我们构建了敲低细胞，虽然Radixin和Ezrin的表达均被抑制了一半以上，但我们能够建立不会显着损害宿主细胞特性的稳定表达系。此外，在这些细胞中确认了MRP2、Ezrin和Radixin的内源表达，并且使用MRP2抗体的免疫沉淀结果表明它们结合在一起。此外，与对照细胞相比，观察到定位于细胞膜的 MRP2 量减少。未来，我们希望培育出表达这种 siRNA 的小鼠，并将其特征与基因敲除小鼠进行比较。