RNA干渉法を用いたトランスポーターノックダウンマウスの作出と薬物動態解析

利用RNA干扰法和药代动力学分析产生转运蛋白敲低小鼠

基本信息

批准号：
03F03305
负责人：
杉山雄一
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F03305/
关键词：
トランスポーター RNAi ERMタンパク ERM蛋白

项目摘要

肝臓の血管側膜および胆管側膜には、薬物の体内動態決定要素として重要なトランスポーターが複数発現している。一般的に、トランスポーターの基質の選択性は重複する場合が多いこと、さらにそれぞれの基質によりこの重複も変化することが知られている。従って基質選択性に関するそれぞれのトランスポーターの寄与を解析するためには、現状としてそれぞれの特異的な阻害剤を用いたり、ノックアウトマウスを作成し解析を行っている。しかし特異的な阻害剤が見つからない場合も多いこと、またノックアウトマウスの作成には時間がかかることなどの理由からその解析は困難なことが多い。本課題では、RNA干渉法で特異的にトランスポーターの発現を抑制したノックダウンマウスの作出を目標とし、さらにそれを用いた寄与率の検討を考えている。そこで胆管側膜のトランスポーターに着目し、ERMタンパクをモデル標的タンパクとした検討を行っている。ERM蛋白のひとつであるRadixinをノックアウトしたマウスは胆汁うっ滞を起こすが、これは肝臓の胆管側膜に発現するMRP2が内在化に起因することが近年報告された。つまり、ノックダウンマウスの機能解析は胆汁うっ滞を起こしているか否かで比較的容易に検討することができると思われる。前年度に引き続き、ノックダウン細胞の構築を行ったところ、Radixin, Ezrinそれぞれの発現が半分以上抑制されているが、ホスト細胞の性質はあまり損なわれていない安定発現株を樹立することができた。また、この細胞には内在的にMRP2およびEzrin、Radixinの発現が確認されているが、MRP2抗体を用いた免疫沈降の結果よりそれらが結合していることが示された。さらにコントロール細胞と比較して、細胞膜に局在するMRP2量の減少が観察された。今後はこのsiRNAを発現するマウスを作成し、その特性をノックアウトマウスと比較したいと考えている。

几种转运蛋白作为药物体细胞动力学的决定因素很重要，在肝脏的血管和胆管膜中表达。通常，众所周知，转运蛋白的底物选择性通常是重叠的，并且此重叠也随着每个底物的变化。因此，为了分析每个转运蛋白对底物选择性的贡献，当前状态是使用每个特定的抑制剂，或者准备敲除小鼠。但是，分析通常很困难，因为通常找不到特定的抑制剂，并且因为创建淘汰小鼠需要时间。在这个主题中，我们旨在产生敲除小鼠，该小鼠通过RNA干涉法专门抑制转运蛋白的表达，并且我们正在考虑进一步考虑使用此方法的贡献率。因此，我们专注于胆管膜中的转运蛋白，并使用ERM蛋白作为模型靶蛋白进行研究。敲除radixin（一种ERM蛋白质）的小鼠引起胆汁淤积，最近据报道是由于MRP2的内在化而引起的，MRP2在肝脏的胆管膜上表达。换句话说，敲低小鼠的功能分析可能相对容易检查是否发生胆汁淤积。在上一年之后，构建了敲低细胞，尽管放射素和埃兹林的表达被一半以上抑制，但我们能够建立一个稳定的表达菌株，在宿主细胞的性质中没有显着损害。此外，尽管在这些细胞中已经证实了MRP2，Ezrin和radixin的表达，但使用MRP2抗体的免疫沉淀表明它们结合。此外，与对照细胞相比，观察到位于细胞膜的MRP2量减少。将来，我们想创建表达这种siRNA并将其特性与淘汰小鼠进行比较的小鼠。