風疹ウイルスレセプターの同定と体内伝播メカニズムの解明

风疹病毒受体的鉴定及内部传播机制的阐明

• 批准号: 22K09586
• 负责人: 森 嘉生
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Institute of Infectious Diseases
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K09586/
• 关键词: 風疹ウイルス; 膜融合; 侵入; スフィンゴミエリン; SMS1; エントリー; レセプター; 経胎盤感染; 先天性風疹症候群

風疹ウイルスの細胞侵入に関与する宿主因子を同定するため、ヒト胎盤絨毛癌細胞を用い、CRISPR/Cas9によるゲノムワイド遺伝子ノックアウトスクリーニングを実施した。その結果、SMS1が候補として同定された。SMS1はスフィンゴミエリン合成酵素であり、本ノックアウトにより細胞中のスフィンゴミエリン量が大幅に低下する。ヒト胎盤絨毛癌細胞JAR細胞ではSMSファミリーのうち、SMS1のみが発現している。本細胞ではSMS1のノックアウトにより風疹ウイルスの細胞侵入は検出されなくなるが、SMS1もしくはSMS2の過剰発現により侵入が回復した。HeLa細胞ではSMS1およびSMS2の両方が発現しているが、両方のノックアウトによって完全に風疹ウイルスの侵入が阻止された。このことはSMSファミリーは風疹ウイルス感染に冗長的に働いていることを示唆している。風疹ウイルス粒子のエンベロープを自己消光濃度の蛍光脂質でラベリングし、膜融合時のlipid mixingを検討したところ、SMS1ノックアウト細胞でもコントロール細胞と同様にlipid mixing自体は生じていた。しかし、その後のヌクレオキャプシドの放出過程を、ゲノムRNAのin situ hybridizationならびにE1タンパク質の蛍光抗体染色を用いて検討したところ、SMS1ノックアウト細胞では、ヌクレオキャプシドの細胞質への放出が認められなかった。このことは風疹ウイルスの完全な膜融合とヌクレオキャプシドの細胞質内への放出に宿主のスフィンゴミエリンが必須であることを示唆するものであった。スフィンゴミエリンによって風疹ウイルスの侵入が厳密に制御されていることから、SMSファミリーは風疹および先天性風疹症候群の治療の有用なターゲットになりうるものと考えられた。

为了确定参与风疹病毒进入细胞的宿主因素，我们使用 CRISPR/Cas9 使用人胎盘绒毛膜癌细胞进行了全基因组基因敲除筛选。结果，SMS1 被确定为候选者。 SMS1是一种鞘磷脂合酶，这种敲除显着减少了细胞中鞘磷脂的含量。在SMS家族成员中，只有SMS1在人胎盘绒毛膜癌JAR细胞中表达。在这些细胞中，通过敲除 SMS1 不再检测到风疹病毒的细胞侵袭，但通过过表达 SMS1 或 SMS2 来恢复侵袭。 HeLa细胞同时表达SMS1和SMS2，敲除这两种细胞可以完全阻止风疹病毒的进入。这表明 SMS 家族在风疹病毒感染中发挥了多余的功能。当我们用自猝灭浓度的荧光脂质标记风疹病毒颗粒的包膜并检查膜融合过程中的脂质混合时，我们发现 SMS1 敲除细胞和对照细胞中都发生了脂质混合。然而，当使用基因组RNA原位杂交和E1蛋白荧光抗体染色检查随后的核衣壳释放过程时，在SMS1敲除细胞中没有观察到核衣壳释放到细胞质中。这表明宿主鞘磷脂对于风疹病毒的完全膜融合和核衣壳释放到细胞质中至关重要。由于风疹病毒的进入受到鞘磷脂的严格控制，因此 SMS 家族被认为是治疗风疹和先天性风疹综合征的潜在有用靶标。