フラビウイルス科ウイルスの複製・成熟に関する研究

黄病毒科病毒的复制和成熟研究

• 批准号: 03J03779
• 负责人: 森 嘉生
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J03779/
• 关键词: フラビウイルス; 日本脳炎ウイルス; コア蛋白質; 核移行シグナル; 複製; 成熟

日本脳炎ウイルス(JEV)を始めとしてフラビウイルスは細胞質内で複製するウイルスでありながら、その構造蛋白質の一つであるコア蛋白質が核内にも移行することが知られている。なぜウイルスがこのように無駄とも思えることを行っているのかを検討した。受入研究室においてこれまでにJEVコア蛋白質の核移行シグナル(NLS)が同定されている。すなわち、アミノ酸42および43位をアラニンに置換するとコア蛋白質の核移行が消失する。そこでまず、この変異をJEVAT31株の感染性cDNAクローンpMWJEATに導入したpMWJEAT/M4243を作製した。pMWJEATおよびpMWJEAT/M4243を鋳型にして合成した完全長のRNAをVero細胞にエレクトロポレーション法で導入し、培養上清中から野生型とNLS変異ウイルスを回収した。これらのウイルスを蚊由来C6/36細胞で継代増幅後、VeroおよびC6/36細胞での増殖性を検討した。変異ウイルスJEAT/M4243に導入したアミノ酸置換は、C6/36細胞で継代増幅後のウイルスでも保存されていた。また、コア蛋白質の特異抗体を用いた蛍光抗体法によって、野生型ウイルスのコア蛋白質は細胞質だけでなく核内にも局在するが、変異ウイルスのコア蛋白質は核内には局在しないことを確認した。変異ウイルスはVero細胞で、野生型ウイルスに比べて非常に小さなプラークを形成した。また、Vero細胞にMOI=5で両ウイルスを接種すると、変異ウイルスでは野生型ウイルスに比べて、培養上清中への感染性ウイルスの放出や感染細胞内でのウイルス蛋白質の産生が遅かった。一方、C6/36細胞では、このような遅延は認められなかった。以上のことからJEVはコア蛋白質を核移行させ、ウイルスの複製・成熟に有利な環境を作り出していることが推測された。

尽管日本脑炎病毒（JEV）等黄病毒是在细胞质内复制的病毒，但众所周知，它们的结构蛋白之一（核心蛋白）也会易位到细胞核中。我们思考了为什么病毒会做这些看似毫无意义的事情。目前，宿主实验室已鉴定出JEV核心蛋白的核定位信号（NLS）。也就是说，用丙氨酸取代氨基酸 42 和 43 消除了核心蛋白的核输入。首先，我们将此突变引入 JEVAT31 菌株的感染性 cDNA 克隆 ​​pMWJEAT 以创建 pMWJEAT/M4243。将使用pMWJEAT和pMWJEAT/M4243作为模板合成的全长RNA通过电穿孔导入Vero细胞，并从培养上清液中回收野生型和NLS突变病毒。这些病毒在蚊子来源的 C6/36 细胞中传代扩增后，检查了它们在 Vero 和 C6/36 细胞中的繁殖特性。即使在 C6/36 细胞中传代扩增后，引入突变病毒 JEAT/M4243 中的氨基酸取代也得以保留。此外，通过使用针对核心蛋白的特异性抗体的荧光抗体方法，我们发现野生型病毒的核心蛋白不仅定位于细胞质，而且定位于细胞核，但突变型病毒的核心蛋白是未证实位于细胞核内。突变病毒在 Vero 细胞上形成的噬斑比野生型病毒小得多。此外，当两种病毒以 MOI 为 5 接种 Vero 细胞时，突变病毒中感染性病毒释放到培养物上清液中以及受感染细胞中病毒蛋白的产生均比野生型病毒慢。另一方面，在 C6/36 细胞中没有观察到这种延迟。由此推测，JEV将核心蛋白转位至细胞核内，创造了有利于病毒复制和成熟的环境。