ピロリ菌感染胃癌の背景にあるBRCA1核移行制御機構の破綻

幽门螺杆菌感染胃癌的 BRCA1 核易位控制机制的破坏

• 批准号: 22K07068
• 负责人: 紙谷 尚子
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07068/
• 关键词: ピロリ菌; CagA; PAR1b; BRCA1

日本人の胃癌患者の99％は、cagA遺伝子を保有するCagA陽性ピロリ菌の慢性感染を基盤として発症する。ピロリ菌は菌体内で産生したCagA蛋白質をヒト胃上皮細胞内に注入する。CagAは上皮細胞極性の形成・維持に必須の役割を担うPAR1bに結合し、そのキナーゼ活性を抑制する結果、上皮細胞極性を破壊する。同時に、CagAはPAR1bを抑制することによりBRCA1の核移行を阻害し、ゲノム不安定性を誘導する。申請者は先行研究において、PAR1b以外のキナーゼによるリン酸化もまたBRCA1の核移行に必要であることを見出した。そこで本研究では、ヒトのキナーゼを標的としたsgRNAライブラリを利用し、BRCA1をリン酸化する責任キナーゼを同定し、CagAがキナーゼ活性に与える効果を解析する。今年度は、BRCA1の核移行を評価する実験系を構築した。相同組換え修復レポーター（HR-GFP）は、制限酵素I-SceIにより生じたDNA二本鎖切断が相同組換えによって修復された場合にのみGFPを発現する。核内BRCA1は相同組換えに必須であることから、BRCA1が核移行した細胞はGFP陽性となる。当初の計画では、ヒト胃上皮細胞由来のAGS細胞を用いてHR-GFP安定発現株を作製し、I-SceI-RFP発現ベクターを一過性導入し、「RFP陽性GFP陽性」と「RFP陽性GFP陰性」にソーティングする予定であった。しかしながら、sgRNAスクリーニングに必要となるRFP陽性細胞数が得られなかった。そこで、樹立したAGS細胞由来のHR-GFP安定発現株を用いて、Tet-onシステムでI-SceI-RFPを誘導発現する安定発現株を作製した。ドキシサイクリン添加により、ほぼ全ての細胞でI-SceI-RFPが誘導されることを確認している。

99％的日本胃癌患者是基于携带CAGA基因的CAGA阳性幽门螺杆菌的慢性感染。幽门螺杆菌注射细菌中产生的CAGA蛋白，向人胃上皮细胞中。 CAGA与PAR1B结合，PAR1B在上皮细胞极性的形成和维持中起着至关重要的作用，并抑制其激酶活性，从而破坏了上皮细胞极性。同时，CAGA通过抑制PAR1B并诱导基因组不稳定性来抑制BRCA1的核转运。在先前的研究中，申请人发现BRCA1的核易位还需要激酶以外的激酶磷酸化。因此，在这项研究中，我们使用靶向人类激酶的SGRNA文库来鉴定磷酸化BRCA1的负责激酶，并分析CAGA对激酶活性的影响。今年，我们构建了一个实验系统来评估BRCA1的核易位。仅当由限制酶I-SCEI引起的DNA双链断裂时，同源重组维修记者（HR-GFPS）才能通过同源重组修复DNA双链断裂。核BRCA1对于同源重组至关重要，因此已易位的BRCA1的细胞成为GFP阳性。最初的计划是使用源自人类胃上皮细胞的AGS细胞产生稳定的HR-GFP表达，并暂时引入I-SCEI-RFP表达载体，将其排序为“ RFP阳性GFP阳性阳性”和“ RFP阳性GFP阳性GFP-Negation”。但是，未获得SGRNA筛选所需的RFP阳性细胞的数量。因此，使用源自AGS细胞的已建立的HR-GFP稳定表达菌株制备了诱导I-SCEI-RFP的稳定表达菌株。已经证实，加性霉素的添加几乎在所有细胞中诱导I-SCEI-RFP。