新規高感度O型糖鎖誘導体化試薬の開発

新型高灵敏度O-聚糖衍生化试剂的开发

• 批准号: 22K06559
• 负责人: 正田 卓司
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Institute of Health Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06559/
• 关键词: O結合型糖鎖; 誘導体化試薬; 蛍光; 糖鎖; 分析

【目的】糖タンパク質バイオ医薬品の糖鎖には不均一性があり，培養方法や精製方法などの変動によりそのプロファイルに変化が生じるため，有効性及び安全性に大きな影響を与える可能性がある．したがって，バイオ医薬品の品質を確保するためには，糖鎖の解析が重要となる．糖タンパク質の糖鎖はAsn残基の側鎖に結合するN型糖鎖とSer/The残基の側鎖に結合するO型糖鎖に大別される．N結合型糖鎖は遊離酵素や誘導体化試薬を利用した解析方法が多数あるもの，O結合型糖鎖には手法が少なく，その生理機能も不明な点が多い．本研究では高感度検出が可能なO型糖鎖評価法の開発を目指し，蛍光性糖鎖標識試薬の開発を行った．【方法】　PMPは強塩基，加熱条件下で糖の還元末端に２分子反応する．そこで，ピレンのエキシマー蛍光を利用することを考えた．エキシマー蛍光とは，２分子のピレンが近傍に存在するときに観察される，ピレン単体の蛍光よりも長波長の蛍光である．すなわち，PMPとピレンのエキシマー蛍光を組み合わせることで，未反応の試薬をモノマー蛍光で，糖と反応した試薬をエキシマー蛍光で検出できると考えた．【結果・考察】　PMPとピレンをアルキル鎖でつないだMPPPをデザインし(Fig. 1)，アルキル鎖長が異なる誘導体を複数合成した．NaOH存在下，70℃でGalNAcとMPPPを反応させ，LCMSで分析したところ目的生成物のピークを確認した．そのピークにはエキシマー蛍光があり，未反応の試薬のモノマー蛍光と明確に区別することができた．また，エキシマー蛍光の強度は，アルキル鎖長に依存した．

[目的]糖蛋白生物药物的糖基化链是异质的，由于培养方法和纯化方法的变化，其剖面可能会发生变化，这可能对功效和安全性产生重大影响。因此，为了确保生物药物的质量，对糖链的分析很重要。糖蛋白的糖基化链可以大致分为N型聚糖，它们与与Ser/残基的侧链结合的ASN残基和O型聚糖的侧链结合。使用游离酶和衍生化试剂的N连锁糖链有许多方法，而O连锁糖链的方法很少，其生理功能却未知。在这项研究中，我们开发了一种荧光聚糖标记试剂，其目的是开发一种可以高度敏感检测到的O型聚糖的方法。 [方法] PMP在强碱和加热条件下的糖还原末端的两个分子中反应。因此，我们考虑使用pyr烯的准分子荧光。准分子荧光为荧光，波长比单独的pyrene荧光更长，当时在附近存在两个pyr烯时观察到。换句话说，我们认为，通过将PMP和Pyrene Excimer荧光结合，可以使用单体荧光检测到未反应的试剂，并且可以使用精液荧光检测到与糖反应的试剂。 [结果和讨论] MPPP设计在PMP和Pyrene中与烷基链连接（图1），并合成了具有不同烷基链长度的多个衍生物。在NaOH存在下，在70°C下在70°C中反应GalNAC和MPPP，并通过LCMS分析确认目标产物的峰。峰是准分子荧光，它与未反应试剂的单体荧光显然可以区分。此外，准分子荧光的强度取决于烷基链长度。

项目成果

エキシマー蛍光を利用した蛍光性糖鎖標識試薬の開発

利用准分子荧光开发荧光糖链标记试剂

• 发表时间: 2023
• 作者: Ohtsuka Hokuto;Shimasaki Takafumi;Aiba Hirofumi;伊藤海結，関根優莉奈，正田卓司，橋井則貴，原園景，石井明子，井上英史，出水庸介
• 通讯作者: 伊藤海結，関根優莉奈，正田卓司，橋井則貴，原園景，石井明子，井上英史，出水庸介