新規高感度O型糖鎖誘導体化試薬の開発

新型高灵敏度O-聚糖衍生化试剂的开发

• 批准号: 22K06559
• 负责人: 正田 卓司
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Institute of Health Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06559/
• 关键词: O結合型糖鎖; 誘導体化試薬; 蛍光; 糖鎖; 分析

【目的】糖タンパク質バイオ医薬品の糖鎖には不均一性があり，培養方法や精製方法などの変動によりそのプロファイルに変化が生じるため，有効性及び安全性に大きな影響を与える可能性がある．したがって，バイオ医薬品の品質を確保するためには，糖鎖の解析が重要となる．糖タンパク質の糖鎖はAsn残基の側鎖に結合するN型糖鎖とSer/The残基の側鎖に結合するO型糖鎖に大別される．N結合型糖鎖は遊離酵素や誘導体化試薬を利用した解析方法が多数あるもの，O結合型糖鎖には手法が少なく，その生理機能も不明な点が多い．本研究では高感度検出が可能なO型糖鎖評価法の開発を目指し，蛍光性糖鎖標識試薬の開発を行った．【方法】　PMPは強塩基，加熱条件下で糖の還元末端に２分子反応する．そこで，ピレンのエキシマー蛍光を利用することを考えた．エキシマー蛍光とは，２分子のピレンが近傍に存在するときに観察される，ピレン単体の蛍光よりも長波長の蛍光である．すなわち，PMPとピレンのエキシマー蛍光を組み合わせることで，未反応の試薬をモノマー蛍光で，糖と反応した試薬をエキシマー蛍光で検出できると考えた．【結果・考察】　PMPとピレンをアルキル鎖でつないだMPPPをデザインし(Fig. 1)，アルキル鎖長が異なる誘導体を複数合成した．NaOH存在下，70℃でGalNAcとMPPPを反応させ，LCMSで分析したところ目的生成物のピークを確認した．そのピークにはエキシマー蛍光があり，未反応の試薬のモノマー蛍光と明確に区別することができた．また，エキシマー蛍光の強度は，アルキル鎖長に依存した．

[目的]糖蛋白生物药物的糖链具有异质性，其结构因培养方法、纯化方法等的变化而发生变化，可能对疗效和安全性产生重大影响。因此，聚糖分析对于确保生物药品的质量非常重要。糖蛋白糖链大致分为与Asn残基侧链结合的N型糖链和与Ser/The残基侧链结合的O型糖链。尽管使用游离酶和衍生化试剂分析N-连接聚糖的方法很多，但分析O-连接聚糖的方法较少，并且其生理功能的许多方面仍然未知。在本研究中，我们开发了一种荧光聚糖标记试剂，旨在开发一种可进行高灵敏度检测的 O-聚糖评估方法。 [方法]在强碱和加热条件下，两分子PMP与糖的还原端发生反应。因此，我们想到利用芘的准分子荧光。准分子荧光是比单独的芘的荧光波长更长的荧光，当附近存在两个芘分子时观察到这种荧光。换句话说，通过将PMP和芘准分子荧光相结合，我们认为可以使用单体荧光来检测未反应的试剂，并且可以使用准分子荧光来检测与糖反应的试剂。 [结果/讨论] 我们设计了PMP和芘通过烷基链连接的MPPP（图1），并合成了多种不同烷基链长度的衍生物。当GalNAc和MPPP在NaOH存在下于70℃反应并通过LCMS分析时，确认了所需产物的峰。该峰含有准分子荧光，可以与未反应试剂的单体荧光清楚地区分开。此外，准分子荧光的强度取决于烷基链的长度。

项目成果

エキシマー蛍光を利用した蛍光性糖鎖標識試薬の開発

利用准分子荧光开发荧光糖链标记试剂

• 发表时间: 2023
• 作者: Ohtsuka Hokuto;Shimasaki Takafumi;Aiba Hirofumi;伊藤海結，関根優莉奈，正田卓司，橋井則貴，原園景，石井明子，井上英史，出水庸介
• 通讯作者: 伊藤海結，関根優莉奈，正田卓司，橋井則貴，原園景，石井明子，井上英史，出水庸介