ヒストンの受け渡し活性測定系の開発から探索するヒストンリサイクルの分子機構

通过开发组蛋白递送活性测量系统探索组蛋白回收的分子机制

• 批准号: 22K06210
• 负责人: 日詰 光治
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Saitama Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06210/
• 关键词: DNA複製; ヌクレオソーム; クロマチン; ヒストン; 複製

DNA複製に伴い、鋳型鎖ヒストンを新生鎖で再利用するヒストンリサイクルが行われる。本研究ではヒストンリサイクルの生化学的再構築を目指す。とりわけ、（１）鋳型鎖からヒストンを受け取って保持し、（２）そのヒストンを新生鎖のヌクレオソーム形成に供する、という二つのステップを各々測定するアッセイ系を開発することを目指す。まず、ヒストンシャペロンと考えられている複製ヘリカーゼ複合体のサブユニットMcm2のN末端領域（ここではMcm2Nとよぶ）を、任意のDNA領域に固定する手法の確立を目指した。いくつかの方法を試した結果、最終的に、Mcm2NをLexAとの融合タンパク質として精製して、SOS-Box領域をもつDNAと結合させることで、安定に領域特異的なDNA-Mcm2N結合を確立した。来年度以降は、この系を用いて、Mcm2Nを固定したDNA領域周辺に対するヒストンローディング（すなわちヌクレオソーム形成）について、検討する。Mcm2Nは複製フォークの進行の方向において、もっとも前方に位置するため、解離した鋳型鎖ヌクレオソームから放出されたヒストンに最も初期にアクセスすると考えられる。Mcm2Nが捕捉したヒストンは、より新生鎖に近接する複製フォーク後方の因子に受け渡され、最終的に新生鎖に結合すると考える。したがって、Mcm2Nが結合したヒストンタンパク質をどの因子に受け渡すか、生化学的な競合実験で試した。Mcm2Nとヒストンとを結合させておき、そこにDpb3-Dpb4などのヒストンシャペロン複製因子を加える実験を行っている。これまでに、加える因子依存的に、Mcm2Nとヒストンとの結合が促進／阻害される様子が予備的に検出されているため、来年度以降、さらに詳細な解析を進める。

DNA复制后，通过重复新链中的模板链组蛋白来进行组蛋白回收。这项研究旨在对组蛋白回收的生化重建。特别是，我们旨在开发一个测量两个步骤中每个步骤的测定系统：（1）从模板链中接收和保留组蛋白，以及（2）将组蛋白在新生的链中进行核小体形成。首先，我们旨在建立一种将复制解旋酶复合物的亚基MCM2固定的方法（此处称为MCM2N）（被认为是组蛋白伴侣）到任何DNA区域。尝试了几种方法之后，我们最终通过将MCM2N纯化为具有LEXA的融合蛋白并与携带SOS盒区域的DNA结合，最终建立了稳定的区域特异性DNA-MCM2N结合。从明年开始，该系统将用于研究MCM2N固定的DNA区域周围的组蛋白负荷（即，核小体形成）。由于MCM2N位于复制叉进程的方向上最前进，因此被认为是对从解离模板链核体释放的组蛋白的最早访问。据认为，由MCM2N捕获的组蛋白被传递给更接近新生链的复制叉背后的因素，并最终与新生的链结合。因此，我们测试了转移MCM2N结合的组蛋白蛋白的哪些因素。我们进行了实验，其中将MCM2N和组蛋白组合在一起，并将组蛋白伴侣复制因子（例如DPB3-DPB4）添加到混合物中。到目前为止，已经最初发现MCM2N和组蛋白之间的结合以因子依赖性方式促进/抑制，因此将从明年开始进行进一步的详细分析。