構造生物学的アプローチによるタイトジャンクションの透過制御

使用结构生物学方法控制紧密连接渗透性

• 批准号: 22K06200
• 负责人: 中村 駿
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06200/
• 关键词: タイトジャンクション; クローディン; 構造生物学

本研究は、タイトジャンクション構造基盤を解明し、その透過制御を可能とするモジュレータの創製を目指している。本年度は、構造未解明であるクローディンサブタイプのX線結晶構造解析に向けた実験及びクローディンサブタイプ特異的な結合親和性を高めたC-CPEの改変を進めた。研究開始時に構造未解明であるクローディンサブタイプについて結晶が得られていたため、その結晶性を高める検討を進めた。精製条件及び結晶化条件の最適化を進めてＸ線回折実験を行った結果、5Å程度の回折データが得られた。構造決定にはさらなる改善が必要であるため、結晶性を改善するためにＮ末端リンカーの長さを最小限にしたコンストラクトの検討を行い、良好に発現及び精製であることを確認できた。このコンストラクトについては今後結晶化及びＸ線回折実験を行い、結晶性の改善効果の評価を進め、分解能の改善を目指す。また、研究代表者がこれまでに構造決定したクローディン３とC-CPEの複合体の構造情報を基にして変異体を作製し、タンパク質レベルでのクローディンとC-CPEの相互作用解析を行い、C-CPE改変体の探索を行った。クローディンサブタイプによって特徴的な箇所における相互作用に着目した改変によって、特定のクローディンサブタイプへの結合親和性を高める可能性のあるC-CPEの複数種のアミノ酸変異を見出した。すなわち、クローディンサブタイプ間でアミノ酸残基の側鎖の大きさが異なる箇所に着目し、その箇所におけるC-CPE側のアミノ酸残基を変えることによって、側鎖の大きさに依存した親和性を示す変異を見出すことができた。

这项研究旨在创建一个调制器，以阐明紧密的连接结构基础并实现其透明度控制。在这个财政年度，进行了实验，用于对Clodin sub类型的X射线晶体结构分析进行，该实验已被拆开，而C-CPE（增加了特异性结合亲和力）已被修改。在研究开始时，获得了crodinsub型的晶体，该类型被拆开，因此我们检查以增加其晶体特性。通过促进纯化和结晶条件的优化进行X射线衍射实验，获得了约5Å的衍射数据。由于结构决策需要进一步改进，因此我们以N末端接头的最小长度检查了构造，以改善结晶度，并确认它是表达和纯化的。该结构将进行结晶和X射线衍射实验，旨在评估结晶度的有效性，并旨在改善分辨率。另外，基于Clodin 3和C-CPE的复合材料的结构信息，该突变体已确定，并分析了Crodin和C-CPE在蛋白质水平上的相互作用。 C-CPE修改。侧重于Clodin sub类型中特征部分相互作用的修改发现了C-CPE的几种类型的氨基酸，这可能会增加与特定crodinsub类型的结合亲和力。也就是说，重点是crodinsab类型之间的氨基酸残基的大小，氨基酸残基的大小不同，并且通过更改C-CPE一侧的氨基酸残基，侧链的活力取决于侧链的大小。