構造生物学的アプローチによるタイトジャンクションの透過制御

使用结构生物学方法控制紧密连接渗透性

• 批准号: 22K06200
• 负责人: 中村 駿
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06200/
• 关键词: タイトジャンクション; クローディン; 構造生物学

本研究は、タイトジャンクション構造基盤を解明し、その透過制御を可能とするモジュレータの創製を目指している。本年度は、構造未解明であるクローディンサブタイプのX線結晶構造解析に向けた実験及びクローディンサブタイプ特異的な結合親和性を高めたC-CPEの改変を進めた。研究開始時に構造未解明であるクローディンサブタイプについて結晶が得られていたため、その結晶性を高める検討を進めた。精製条件及び結晶化条件の最適化を進めてＸ線回折実験を行った結果、5Å程度の回折データが得られた。構造決定にはさらなる改善が必要であるため、結晶性を改善するためにＮ末端リンカーの長さを最小限にしたコンストラクトの検討を行い、良好に発現及び精製であることを確認できた。このコンストラクトについては今後結晶化及びＸ線回折実験を行い、結晶性の改善効果の評価を進め、分解能の改善を目指す。また、研究代表者がこれまでに構造決定したクローディン３とC-CPEの複合体の構造情報を基にして変異体を作製し、タンパク質レベルでのクローディンとC-CPEの相互作用解析を行い、C-CPE改変体の探索を行った。クローディンサブタイプによって特徴的な箇所における相互作用に着目した改変によって、特定のクローディンサブタイプへの結合親和性を高める可能性のあるC-CPEの複数種のアミノ酸変異を見出した。すなわち、クローディンサブタイプ間でアミノ酸残基の側鎖の大きさが異なる箇所に着目し、その箇所におけるC-CPE側のアミノ酸残基を変えることによって、側鎖の大きさに依存した親和性を示す変異を見出すことができた。

这项研究旨在阐明紧密的连接结构基础，并创建一个调制器，使其能够控制其传输。今年，我们进行了针对Claudin亚型的X射线晶体结构分析的实验，该实验尚未阐明，C-CPE的修改增强了对Claudin uspype的结合亲和力。由于在研究开始时没有已知结构的Claudin亚型晶体，因此我们开始研究以改善克劳丁亚型的结晶度。优化纯化和结晶条件后，进行了X射线衍射实验，并获得了约5Å的衍射数据。由于结构确定需要进一步的改进，我们研究了N末端接头长度最小的结构，以改善结晶度，并确认它们表达良好和纯化。将来，该结构将进行结晶和X射线衍射实验，并将评估以改善结晶度的影响，并旨在改善分辨率。此外，主要研究者根据迄今已确定的Claudin-3和C-CPE复合物的结构信息创建了突变体，并在蛋白质水平上分析了Claudin和C-CPE之间的相互作用，并搜索了C-CPE变体。通过通过Claudin亚型在独特的位点进行相互作用，我们发现C-CPE中的多个氨基酸突变可能会增加对特定Claudin亚型的结合亲和力。换句话说，通过关注氨基酸残基的侧链尺寸在Claudin亚型之间不同的位置，并在该位置更改C-CPE侧的氨基酸残基，发现了依赖于侧链大小的亲和力的突变。