リピート結合性小分子を用いた１型筋強直性ジストロフィーの化学生物学的研究

使用重复结合小分子对 1 型强直性肌营养不良进行化学生物学研究

• 批准号: 17J02038
• 负责人: 松本 惇
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-04-26 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J02038/
• 关键词: トリヌクレオチドリピート病; 1型筋強直性ジストロフィー; CUGリピート; RNAの二次構造; RNA結合分子; 分子設計; 結合シミュレーション; RNAと蛋白質の相互作用

【リガンドの結合が及ぼすRNAの構造変化】PPDIQとRNAの複合体構造解明への知見を得るために、RNAの二重鎖内外でのウラシルに対するヒドラジンの反応性の違いを利用したケミカルプロービングを行い、続くアニリン処理によるRNAの切断反応を用いてウラシルの置かれる環境を解析した。その結果PPDIQ存在下で顕著なRNAの切断が引き起こされ、PPDIQが結合したU-Uミスマッチ部位ではウラシルのフリップアウトが誘起されていることが明らかとなった。【リガンドによるDM1筋芽細胞の凝集体形成阻害】大阪大学医学研究科中森博士の協力の下、DM1患者の筋芽細胞及びDM1モデル細胞・マウスを用いたPPDIQ及びDPPDIQのIn vivo評価を行った。FISHプローブを用いDM1患者の筋芽細胞の核内に形成されるCUGリピートとMBNL1の凝集体の観察を行った系では、DPPDIQ添加後において顕著な凝集体に相当するプローブの蛍光の消失が観測され、細胞内においてリガンドによるCUGリピートとMBNL1の相互作用形成の阻害を強く示唆した。【DM1モデル細胞・モデルマウスの選択的スプライシング回復効果】DM1細胞の、MBNL1が関与する選択的スプライシングの制御下にあるmRNAの正常型産生率を逆転写PCRを用いて解析した。PPDIQ、DPPDIQどちらを添加した際にも正常型産生率の改善が見られ、リガンドが細胞中のMBNL1の機能回復に寄与したことが明らかとなった。それに加え、DPPDIQはPPDIQに比べ効果的なスプライシング回復効果を示した。同様の評価をモデルマウスにおいても行った。観察を行ったClcn1、Atp2a1どちらの遺伝子においてもDPPDIQを20mg/kgまで腹腔内投与した際、70％のスプライシング回復率を達成した。以上のことより本研究において開発したリガンドがDM1の症状を改善する可能性を強く示し、DM1治療法確立への新規リード化合物となりえる結果であった。

[配体结合引起的RNA结构变化]为了深入了解PPDIQ和RNA之间的复合物的结构，我们利用RNA双链体内外肼对尿嘧啶反应性的差异进行了化学探测。使用随后由苯胺处理引起的RNA切割反应来分析放置的尿嘧啶。结果表明，在PPDIQ的存在下引起显着的RNA切割，并且在PPDIQ结合的U-U错配位点处诱导尿嘧啶的翻转。 [配体抑制 DM1 成肌细胞聚集体形成] 我们与大阪大学医学研究生院中森博士合作，使用 DM1 患者、DM1 模型细胞和小鼠的成肌细胞进行了 PPDIQ 和 DPPDIQ 的体内评估。在我们使用 FISH 探针观察 DM1 患者成肌细胞核中形成的 CUG 重复和 MBNL1 聚集体的系统中，在添加 DPPDIQ 后观察到与聚集体相对应的探针荧光显着消失。细胞内的配体抑制了CUG重复序列与MBNL1之间的相互作用。 [恢复选择性剪接对DM1模型细胞和模型小鼠的影响] 采用逆转录PCR分析DM1细胞中MBNL1选择性剪接控制下的mRNA正常生成率。当添加 PPDIQ 或 DPPDIQ 时，观察到正常生产率的提高，表明配体有助于细胞中 MBNL1 的功能恢复。此外，DPPDIQ表现出比PPDIQ更有效的剪接恢复效果。对模型小鼠也进行了类似的评估。当对 Clcn1 和 Atp2a1 基因腹腔注射 20 mg/kg DPPDIQ 时，剪接恢复率达到 70%。上述结果有力地表明本研究开发的配体具有改善DM1症状的潜力，并可以作为建立DM1治疗的新先导化合物。

项目成果

ovel isoquinoline derivatives that inhibit MBNL1-CUG repeat interaction in Myotonic Dystrophy type1

抑制 1 型强直性肌营养不良中 MBNL1-CUG 重复相互作用的新型异喹啉衍生物

• 发表时间: 2017
• 作者: Jun Matsumoto;Jinxing Li;Asako Murata;Chikara Dohno;Kazuhiko Nakatani
• 通讯作者: Kazuhiko Nakatani