メロテルペノイド生合成マシナリーの機能と構造に関する研究

类萜生物合成机制的功能与结构研究

基本信息

批准号：
17F17400
负责人：
葛山智久
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-11-10 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17F17400/
关键词：
メロテルペノイド放線菌生合成

项目摘要

本研究課題では、Streptomyces sp. BK97が生産する２つのメロテルペノイド、ベントシアニンとデメチルナフテルピンの生合成マシナリーの機能に関する研究を行なった。まず、Streptomyces sp. BK97からゲノムDNAを調製して、ゲノムシーケンスデータを得るとともにBACライブラリーを構築し、バイオインフォマティクスを駆使して、ベントシアニン及びナフテルピン生合成の候補遺伝子を見つけた。驚いたことに、これら２つのメロテルペノイドの生合成遺伝子はゲノム上で連続して存在していた。また、これらの遺伝子クラスターにはナフテルピンの生合成の鍵酵素であるABBAプレニル基転移酵素が２コピー含まれていることも判明した。そこで、これらのプレニル基転移酵素の系統解析を行ったところ、明らかに２つに分類することができた。一つは、炭素－炭素結合に関与すると考えられる酵素で、他方は、窒素－炭素結合に関与すると考えられる酵素であり、両者が配列的に明確に区別できることが明らかになった。これら２つのプレニル基転移酵素を大腸菌内で可溶性酵素として調製することができたので、今後は、本特別研究員の在籍期間中（2019年11月まで）に、これら２つのプレニル基転移酵素の基質を同定してin vitroでプレニル化活性を検出する予定である。そのため、現在、これら２つのABBAプレニル基転移酵素遺伝子の破壊株を作製し、それらの破壊株が蓄積する生合成中間体の精製を行っているところである。異種放線菌であるStreptomyces lividansとStreptomyces albusを宿主として得られたBACクローンの異種発現を試みたが、ベントシアニンとデメチルナフテルピンの生産は確認できなかった。そこで、生合成遺伝子クラスター中にみいだした６種のTetRやLysRなどの調節因子をBACクローンと共発現させることでベントシアニンとデメチルナフテルピンの異種生産が可能かどうかを確認し、今後、生合成マシナリーの同定を完結する。

在这个研究项目中，我们研究了由链霉菌 BK97 产生的两种类萜（苯托花青和去甲基萘萜）的生物合成机制的功能。首先，我们制备了链霉菌BK97的基因组DNA，获得了基因组序列数据，构建了BAC文库，并利用生物信息学寻找了苯青素和萘萜品生物合成的候选基因。令人惊讶的是，这两个类萜生物合成基因在基因组中连续定位。还发现这些基因簇含有两个拷贝的 ABBA 异戊烯基转移酶，这是萘松生物合成中的关键酶。因此，当我们对这些异戊烯基转移酶进行系统发育分析时，我们能够清楚地将它们分为两组。一种是被认为与碳-碳键有关的酶，另一种是被认为与氮-碳键有关的酶，并且已经表明可以从序列上清楚地区分这两种酶。由于我们能够在大肠杆菌中制备这两种异戊二烯基转移酶作为可溶性酶，因此我们将在这位特别研究员任职期间（直到 2019 年 11 月）继续制备这两种异戊二烯基转移酶的底物，我们计划对其进行鉴定并检测其异戊二烯化活性。体外。因此，我们目前正在创建这两个 ABBA 异戊烯基转移酶基因的破坏菌株，并纯化这些破坏菌株积累的生物合成中间体。我们尝试使用异源放线菌Streptomyces lividans和Streptomyces albus作为宿主获得的BAC克隆的异源表达，但无法证实苯菁和去甲基萘平的产生。因此，我们通过与BAC克隆共表达生物合成基因簇中发现的TetR和LysR等6个调节因子来确认异源生产本菁和去甲基萘平是否可能，完成生物合成机制的鉴定。