Elucidation of biosynthetic mechanism of diazo group-containing amino acid and the application to novel amino acid production system

含重氮氨基酸生物合成机制的阐明及其在新型氨基酸生产系统中的应用

基本信息

批准号：
22KJ1046
负责人：
川合誠司
金额：
$ 1.6万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

申請者らは過去に、放線菌が生産するジアゾ基含有アミノ酸、6-diazo-5-oxo-L-norleucine (DON) の生合成経路において、新規ファミリーの膜タンパク質であるAzpLがジアゾ化反応を触媒することを同定したが、組換えタンパク質の取得には至っていなかった。本年度はAzpLのC末端にGFPを融合させることで、大腸菌を用いた組換えタンパク質の発現・精製に成功し、試験管内でその活性を確かめることができた。AzpLは既知のジアゾ化酵素と異なり、ATPなどの補因子や補酵素をその活性に必要としないことが分かり、反応機構が根本的に異なることが示唆された。Streptomyces sp. RI-77株が有するジアゾ化反応に必要な遺伝子を含む未知の生合成遺伝子クラスター (avaクラスター) について、異種発現実験によるゲノムマイニングを行ったところ、本クラスターの遺伝子産物がアベナルミ酸を生産することが分かった。各遺伝子破壊株の代謝解析や組換えタンパク質の試験管内解析から全生合成経路を解明した。この経路には、芳香族アミノ基のジアゾ化とジアゾ基へのNADPH由来のヒドリド転移による脱離反応を介した新規なアミノ基除去機構が存在することを明らかにした。更に、ジアゾ化を担うAvaA6のホモログ酵素 (CmaA6) について、X線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡法による解析から、現在までにテトラマーを形成する全体構造を解明した。アベナルミ酸の生合成中間体である、3-ジアゾアベナルミ酸生産菌の培養液に、アセトアセタニライドとその誘導体を添加したところ、細胞内でジアゾ基と活性メチレンが非酵素的にカップリング反応を起こし、フェニルジアゼン骨格を有する新規化合物を生産することがわかった。

申请人先前已经确定，一种新型的膜蛋白家族AZPL催化了6-二唑-5-氧气-L-甲基酸酯（DON）的生物合成途径中的重18zolation反应，这是一种重氮组群氨基酸，是放线肌菌，但尚未通过重新构成蛋白质的蛋白质产生。今年，通过在AZPL的C端融合GFP，我们使用大肠杆菌成功表达并纯化的重组蛋白，并在试管中证实了蛋白质的活性。与已知的重氮酶不同，AZPL不需要辅助因子（例如ATP或辅酶）才能进行活性，这表明反应机制在根本上是不同的。当基因组挖掘使用在未知的生物合成基因簇（AVA簇）上进行异源表达实验时，该实验包含链霉菌链霉菌反应所需的基因。链霉菌菌株RI-77是使用异源表达实验开采的基因组，发现该簇的基因产物会产生avenalmic酸。通过对每种基因破坏菌株的代谢分析和重组蛋白的体外分析来阐明总生物合成途径。该途径表明，通过消除芳香族氨基群和Daidotransfer对大道组的消除反应，存在一种新型的氨基群体去除机制。此外，负责重氮化的同源酶（CMAA6）的整体结构已通过X射线晶体结构分析和avaA6同源酶（CMAA6）的冷冻电子显微镜分析（CMAA6）澄清，这是负责重新Zozogzotizatization的负责。当将乙酰乙酰烷胺及其衍生物添加到3-二苯甲酸盐产生的细菌的培养基中时，添加了一种用于avenalmate的生物合成中间体，乙酰乙烯胺及其衍生物及其衍生物添加了衍生物，因此发现已经发现了非直肠和活性的甲基化蛋白质的复合反应，并产生了甲基化的复合。苯二嗪骨干。