非天然型プレニル化芳香族化合物合成系の構築とその利用

非天然异戊二烯化芳香族化合物合成体系的构建及其应用

基本信息

批准号：
18018008
负责人：
葛山智久
金额：
$ 4.67万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

1.novobiocin生産菌、Streptomyces niveus 由来のNovQの機能解析Streptomyces niveusのnovobiocin生合成遺伝子クラスター中にコードされているNovQの基質特異性を解析するため、大腸菌での発現系を構築した。NovQはこれまでの研究で、DMAPPをプレニル基供与体、4-hydroxyphenyl pyruvate (4-HPP)をプレニル基受容体として、二価金属イオン非存在下で、dimethylallyl化された4-HPPを生成することが報告されている。しかしながら、4-HPPの構造アナログであるtyrosineやhydroxyphenyl lactate、hydroxybenzoateとは反応しないことが明らかにされており、それ以上の基質特異性については調べられていない。発現ベクターpHIS8にnovQ遺伝子を導入したプラスミドを構築し、大腸菌BL21(DE3)株で発現させて組換えタンパク質を取得した。次に、精製した組換えタンパク質NovQを炭素数5のジメチルアリル2リン酸存在下、フラボノイドとしてはナリンゲニン、ダイゼイン、ゲニステイン、クリシン、ガランギン、イソサクラネチン、フェニルプロパノイドとしてはp-クマル酸とカフェ酸、ポリケチドとしてはオリベトール、レスベラトロール、フラビオリンを使用し、反応を行った。その結果、予想に反して、NovQはナリンゲニン、ダイゼイン、ゲニステインと反応すること、さらには、p-クマル酸と反応して、ドゥルパニンを生成することが判明した。また、レスベラトロールとも反応し、そのプレニル化の位置は、これまでのプレニル化反応とは異なることが判明した。2.NphBを用いた反応機構の解明NphBを用いた詳細な酵素学的パラメーターの解析からは、この反応が逐次定序反応で進行することを明らかにした。さらには、結晶構造データを基に、GPPが第一基質であること、GPPから生じるゲラニルカチオンが芳香族基質上の電子と作用することでC-C結合が形成されることを提唱した。

1. 来自新生霉素生产细菌雪白链霉菌的 NovQ 的功能分析为了分析雪白链霉菌新生霉素生物合成基因簇中编码的 NovQ 的底物特异性，我们在大肠杆菌中构建了表达系统。在之前的研究中，NovQ已经报道了在没有二价金属离子的情况下，使用DMAPP作为异戊二烯基供体和4-羟基苯基丙酮酸（4-HPP）作为异戊二烯基受体生成二甲基烯丙基化的4-HPP。然而，已表明它不会与酪氨酸、乳酸羟基苯酯和羟基苯甲酸酯（4-HPP 的结构类似物）发生反应，并且尚未研究进一步的底物特异性。将novQ基因导入表达载体pHIS8构建质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达，获得重组蛋白。接下来，在5碳二甲基烯丙基二磷酸、柚皮素、黄豆苷元、金雀异黄素、白杨素、高良姜素、异皂苷等类黄酮、对香豆酸、咖啡酸等苯丙素的存在下，添加纯化的重组蛋白NovQ，进行反应。使用橄榄醇、白藜芦醇和黄酮化合物作为聚酮化合物。结果，与预期相反，发现NovQ与柚皮素、大豆黄酮和染料木黄酮反应，并进一步与对香豆酸反应生成杜帕宁。还发现它与白藜芦醇反应，异戊二烯化的位置与以往的异戊二烯化反应不同。 2.利用NphB阐明反应机理利用NphB进行详细的酶参数分析表明该反应以连续有序的方式进行。此外，根据晶体结构数据，他们提出GPP是主要底物，C-C键是由GPP产生的香叶基阳离子与芳香族底物上的电子相互作用形成的。