放線菌の生産するラバンドリル基を持つフェナジン化合物の生合成研究

放线菌产生的薰衣草基吩嗪类化合物的生物合成研究

基本信息

批准号：
06F06430
负责人：
葛山智久
金额：
$ 1.54万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

Phenazine-1-carboxylic acid(PCA)生合成遺伝子群を有するコスミドphzCos8を異種放線菌であるStreptomyces lividans TK23株に導入した。HPLC及びLCMS分析より、この形質転換株から目的化合物lavanducyanin(LAV)の生産は確認されなかったが、LAVの生合成中間体であるPCAの生産を確認した。次に、PCA生合成遺伝子群(orf11-orf18)最小単位のクラスターのS.albus G153形質転換株を作製し、HPLC分析よりPCAの生産を確認した。phzCos8塩基配列の相同検索結果より、すぐ下流にあるorf9とorf10は他のorfsより相同性が低いことから、LAV生合成に関与するprenyltransferase(PTase)の可能性が考えられたためorf9-orf18クラスターのS.albus G153形質転換株も作製し、HPLC及びLCMSよりPCAの生産を確認したが、LAVの生産は検出できなかった。なお、PCAの構造は形質転換株培養物から分離精製したものを^1H及び^<13>C NMRスペクトルの解析より同定した。phzCos8のS.lividans形質転換株はLAVを生産しないことから、生合成遺伝子群の発現を制御していると考えられるorf8(放線菌の径路特異的転写因子SARPとの相同性有り)の発現量が少ないためではないかと考えられ、pYTM1epvectorにorf8を組み込んだplasmidを作製し、さらにphzCos8_S.lividans株に形質転換した。しかしながら、HPLC及びLCMS分析においては、LAVの生産は確認できなかった。上記の異種発現実験にLAVの生産が確認されなかったため、phzCos8のベクター(pTOYAMAcosからpOJ446へ)の入れ替えを行い、得られたphzCos8/pOJ446をS.albus G153株に形質転換した。同様の手法で、その形質転換体からはPCAの生産しか確認できなかった。よって、LAV生合成のPTaseはphzCos8以外のクラスターに存在する可能性が高いと示唆された。

将包含吩嗪-1-羧酸（PCA）生物合成基因组的粘粒 phzCos8 引入异源放线菌，浅青紫链霉菌菌株 TK23 中。 HPLC和LCMS分析并未证实该转化菌株产生了目标化合物lavanducyanin (LAV)，但证实了PCA（LAV的生物合成中间体）的产生。接下来，制备含有最小PCA生物合成基因簇(orf11-orf18)的转化S.albus G153菌株，并通过HPLC分析确认PCA的产生。根据phzCos8核苷酸序列的同源性搜索结果，紧邻其下游的orf9和orf10的同源性低于其他orf，表明它们可能是参与LAV A转化菌株的S.albus G153的异戊烯基转移酶(PTase)。也产生了PCA，并且通过HPLC和LCMS确认了PCA的产生，但无法检测到LAV的产生。通过分析从转化菌株培养物中分离和纯化的PCA的 1 H和 13 C NMR谱来鉴定PCA的结构。由于phzCos8的变青链球菌转化菌株不产生LAV，因此认为这可能是控制生物合成基因表达的orf8（与放线菌途径特异性转录因子SARP同源）的表达水平。由于phzCos8_S.lividans的量较少，因此我们制作了将orf8整合到pYTM1epvector中的质粒，并进一步将其转化到phzCos8_S.lividans菌株中。然而，在HPLC和LCMS分析中，无法证实LAV的产生。由于在上述异源表达实验中未确认LAV的产生，因此替换phzCos8载体(pTOYAMAcos至pOJ446)，并将获得的phzCos8/pOJ446转化至S.albus G153菌株中。使用相同的方法，仅确认转化体产生PCA。因此，表明用于LAV生物合成的PTase很可能存在于phzCos8以外的簇中。