メチル化ＤＮＡ選択的結合ＴＡＬＥタンパク質の創製とエピジェネティクス研究への展開

选择性结合甲基化DNA的TALE蛋白的构建及其在表观遗传学研究中的应用

基本信息

批准号：
15J09770
负责人：
辻将吾
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、昨年度得られた知見を元により5mC選択性の高い変異体TALEユニットを獲得するべく、4つのアミノ酸ランダム化部位のうちC末端側2つのアミノ酸をアラニンに固定したライブラリーを作製しスクリーニングを行った。その結果、複数の候補変異体が得られた。それらの塩基選択性をルシフェラーゼアッセイにより個別に評価したところ、5mC選択性が高いユニットが多く含まれていた。その中でも最も活性が高かったユニットを最終的な人工ユニットとして採用した。この人工ユニットを用いたTALEの結合活性を精製タンパク質を用いたゲルシフトアッセイによって評価した。その結果、人工ユニットを含むTALEは、C配列に比べて、5mC配列に対して2倍程度高い結合親和性を示すことがわかった。創製した人工ユニットが内在ゲノムDNAのメチル化を識別できるかを検討するため、人工ユニットを用いて細胞内ゲノムの5mC部位を標的としたTALEを作製した。このTALEに転写活性化ドメインを融合することで人工転写因子を作製し、標的内在遺伝子のメチル化状態依存的な活性化を試みた。その結果、TALE標的部位が非メチル化状態の細胞群に比べて、メチル化状態である細胞群において有意に転写を活性化したことから、人工ユニットが細胞内ゲノムを標的とした場合にも機能することがわかった。今後、人工ユニットを用いたTALEの5mC機能解析への応用が期待される。

根据去年获得的发现，我们创建了一个文库，其中四个氨基酸随机位点的C末端的两个氨基酸固定在丙氨酸上并进行筛选，以获取具有高5MC选择性的突变故事单位。结果，获得了多个候选突变体。它们的基本选择性通过荧光素酶测定分别评估，发现许多单元都是高度选择性的5MC。这些单元中最活跃的单元被用作最终人造单元。使用该人工单位的故事的结合活性通过使用纯化蛋白质的凝胶移位测定进行评估。结果，发现包含人工单位的故事表现出与C序列相比的结合亲和力，大约是5MC序列的两倍。为了研究创建的人造单元是否可以鉴定内源基因组DNA的甲基化，我们创建了针对细胞内基因组的5MC位点的故事。通过将转录激活结构域与该故事融合，产生了人工转录因子，并尝试了目标内源基因的甲基化依赖性激活。结果，与非甲基化细胞组相比，甲基化细胞组的转录被显着激活，发现当靶向细胞内基因组时，人造单位也起作用。预计将来将使用人工单元应用于5MC的故事分析。