メチル化ＤＮＡ選択的結合ＴＡＬＥタンパク質の創製とエピジェネティクス研究への展開

选择性结合甲基化DNA的TALE蛋白的构建及其在表观遗传学研究中的应用

基本信息

批准号：
15J09770
负责人：
辻将吾
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、昨年度得られた知見を元により5mC選択性の高い変異体TALEユニットを獲得するべく、4つのアミノ酸ランダム化部位のうちC末端側2つのアミノ酸をアラニンに固定したライブラリーを作製しスクリーニングを行った。その結果、複数の候補変異体が得られた。それらの塩基選択性をルシフェラーゼアッセイにより個別に評価したところ、5mC選択性が高いユニットが多く含まれていた。その中でも最も活性が高かったユニットを最終的な人工ユニットとして採用した。この人工ユニットを用いたTALEの結合活性を精製タンパク質を用いたゲルシフトアッセイによって評価した。その結果、人工ユニットを含むTALEは、C配列に比べて、5mC配列に対して2倍程度高い結合親和性を示すことがわかった。創製した人工ユニットが内在ゲノムDNAのメチル化を識別できるかを検討するため、人工ユニットを用いて細胞内ゲノムの5mC部位を標的としたTALEを作製した。このTALEに転写活性化ドメインを融合することで人工転写因子を作製し、標的内在遺伝子のメチル化状態依存的な活性化を試みた。その結果、TALE標的部位が非メチル化状態の細胞群に比べて、メチル化状態である細胞群において有意に転写を活性化したことから、人工ユニットが細胞内ゲノムを標的とした場合にも機能することがわかった。今後、人工ユニットを用いたTALEの5mC機能解析への応用が期待される。

今年，基于去年获得的知识获得了具有高5 mc选择性的可变故事，该文库将两个氨基酸C端酸固定在四个氨基酸随机位点中的丙氨酸。结果，获得了多个候选变体。当通过荧光素酶测定单独评估这些基本选择时，有许多具有高5 mc选择性的单元。其中，最活跃的单元被采用为最终人造单元。使用该人工单位的故事的结合活性通过使用纯化蛋白质的Gelsift分析来评估。结果，发现包含人造单元的故事的结合亲和力大约是5MC序列的两倍。为了考虑创建的人造单元是否可以鉴定内基因组DNA的甲基化，使用人工单位制作故事，以针对细胞内基因组的5MC位点。通过将转录活化域融合到这个故事中，创建了人工转录因子，并尝试了金属内基因来增强甲基化状态依赖性状态。结果，由于与非甲基化细胞组相比，甲基化细胞组的故事位点显着激活了转录，因此即使人造单元靶向细胞内基因组，该功能也起作用。将来，使用人工单位的故事有望应用于5MC功能分析。